主要內(nèi)容：
一、硅基質(zhì)離心柱制備DNA和RNA的工作原理
1. 裂解
裂解方法可能會根據(jù)需要DNA或RNA而有所不同，但其共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。
雜化使氫鍵不穩(wěn)定，范德華力和疏水相互作用。蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，包括核酸酶，核酸與水的結(jié)合被破壞，為核酸與硅機制結(jié)合創(chuàng)造條件。
離液鹽包括鹽酸胍、異硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。
除了離液鹽，裂解緩沖液通常還含有洗滌劑，有助于蛋白質(zhì)的溶解和裂解。
根據(jù)樣品類型，也可以使用酶進行裂解。蛋白酶k就是其中之一，實際上蛋白酶k在裂解緩沖液中起著非常好的作用；蛋白酶k的作用就越好，蛋白質(zhì)變性越完全。然而，溶菌酶在裂解緩沖液的變性條件下不起作用，因此，通常在加入變性鹽之前進行溶菌酶處理。
對于質(zhì)粒的制備，裂解方式與提取RNA或基因組DNA有很大不同，因為必須先從基因組DNA中分離出質(zhì)粒。
如果加入離液鹽，將立即釋放胞內(nèi)物質(zhì)，并且無法從高分子量染色體中區(qū)分出小的環(huán)狀質(zhì)粒。
因此，在質(zhì)粒制備中，直到裂解后，才加入離液鹽，并用于結(jié)合硅基質(zhì)。
2. 結(jié)合硅基質(zhì)（Binding）
離液鹽對裂解和硅基質(zhì)的結(jié)合至關(guān)重要。
為了增強核酸與硅基質(zhì)的結(jié)合，在結(jié)合階段還加入了乙醇。通常是乙醇，但有時可能是異丙醇。
乙醇的濃度和體積對結(jié)合有很大影響，濃度或體積太多會帶來大量降解的核酸和小片段，進而影響UV260的讀數(shù)，使核酸濃度降低。濃度或體積太少，可能很難洗掉膜上的殘留鹽。
重要的一點是，乙醇會影響結(jié)合，并且添加的量對于任何試劑盒都是優(yōu)化的。修改該步驟有助于獲得核酸提取的效果，因此如果遇到問題并希望排除原因，則可以進一步評估該步驟。
另一種問題的診斷方法，保留離心后過柱濾液，并進行沉淀操作，看是否有核酸。如果在裂解過程中使用SDS的表面活性劑，試著用NaCl作為沉淀劑，以避免污染DNA或RNA。
3. 洗滌步驟
裂解液通過硅膠膜離心，現(xiàn)在DNA或RNA與柱結(jié)合，雜質(zhì)，蛋白質(zhì)和多糖則通過。
但是，膜仍然會被殘留的蛋白質(zhì)和鹽弄臟。如果樣本來自植物，膜上仍會殘留多糖，可能還有一些色素，或者如果樣本是血液，膜可能呈棕色或黃色。
清洗步驟有助于去除這些雜質(zhì)。通常有兩種清洗方式，但因樣本類型而異。第一次洗滌通常會用少量的離液鹽來去除蛋白質(zhì)和有色污染物。然后用乙醇清洗以除去鹽。如果樣本本身沒有太多蛋白質(zhì)，如質(zhì)粒準(zhǔn)備或PCR產(chǎn)物純化，那么只需要乙醇清洗即可。
4. 離心柱的干燥
乙醇洗滌后，大多數(shù)操作步驟都有離心來干燥離心柱。這是為了去除乙醇，是清潔洗脫的必要步驟。當(dāng)10mM Tris緩沖液或水填充到膜上進行洗脫時，核酸會水合并從膜上釋放。如果柱上還有乙醇，那么核酸就不能完全再水化。
跳過干燥步驟會導(dǎo)致乙醇污染和核酸產(chǎn)量降低。
這個問題的主要跡象是當(dāng)試圖把樣品加載到瓊脂糖凝膠上時，即使在存在染料的情況下，DNA不會下沉，而是漂浮在緩沖液中。乙醇污染的另一個跡象是，如果你把樣品放在-20攝氏度，它不會結(jié)冰。
5. 洗脫
最后一步是從硅基質(zhì)中釋放出純DNA或RNA。對于DNA的處理，通常使用pH值在8-9之間的10 mM Tris。DNA在稍微堿性的pH下更穩(wěn)定，在緩沖液中溶解更快。即使是DNA顆粒也是如此。水往往趨向于低pH值，低至4-5，在短時間內(nèi)洗脫時，高分子量DNA可能不完全水化。通過讓緩沖液在離心前在膜中停留幾分鐘，可以最大限度地洗脫DNA。
另一方面，RNA在弱酸性pH值下穩(wěn)定，因此水是首選洗脫液。RNA很容易溶于水。
6. 離心柱操作時容易出問題的事兒
核酸回收率低：因素有很多，通常是裂解問題，或者是過柱結(jié)合時條件出現(xiàn)了問題。
確保使用新鮮的優(yōu)質(zhì)乙醇（100%）稀釋緩沖液或添加到過柱結(jié)合步驟。
質(zhì)量差的乙醇或者長期儲存的乙醇可能吸水，導(dǎo)致乙醇濃度發(fā)生變化，如果洗脫緩沖液的配置出現(xiàn)問題，DNA或RNA就會被清洗時流失。
低純度：如果樣品被蛋白質(zhì)污染（低260/280），那么可能是因為樣品太多，蛋白質(zhì)沒有完全去除或溶解。如果樣品的260/230比率很低，則問題通常是來自結(jié)合緩沖液或洗滌緩沖液中的鹽。確保使用最高質(zhì)量的乙醇來制備洗滌緩沖液，如果問題仍然存在，則提取是增加洗滌次數(shù)。
與其他樣品相比，一些樣品含有更多的抑制劑。環(huán)境樣品特別容易出現(xiàn)純度問題，因為在提取過程中腐殖物質(zhì)會被溶解。腐殖質(zhì)類似于DNA，很難從硅膠柱中除去。對于這種類型的樣品，在過柱步驟之前需要使用去除蛋白質(zhì)和腐殖質(zhì)的專門技術(shù)。
降解：主要是RNA，降解是由于樣品儲存不當(dāng)或者裂解效率過低造成的，不過前提是用不含RNase的水洗脫，對于DNA預(yù)處理來說，降解并不是一個大問題，因為對于PCR來說，DNA有降解，擴增依舊可以良好進行。但如果不希望DNA剪切過于嚴(yán)重，那么不要使用太強的裂解方法。?PCR純化注意事項：PCR純化是所有硅基質(zhì)離心柱技術(shù)中最簡單的，因為它只需要添加高濃度的結(jié)合鹽（通常在每個PCR反應(yīng)體系中添加3-5倍體積）并離心柱體。因此，當(dāng)PCR純化試劑盒操作失敗時，可能會特別令人沮喪。所以純化前，最好在凝膠上檢測一下擴增結(jié)果。
PCR反應(yīng)體系中太多物質(zhì)可在UV260處有吸收峰：核苷酸、洗滌劑、鹽和引物。PCR純化試劑盒操作失敗多數(shù)是因為沒有獲得擴增產(chǎn)物。
如果確定反應(yīng)體系中，有PCR產(chǎn)物且濃度不低，可以保留過柱后的液體，如果DNA沒有發(fā)生結(jié)合，還可以進行挽救，重新進行純化。
二、DNA連接酶工作原理
DNA連接酶（EC 6.5.1.1）以共價方式將DNA的磷酸骨架與平末端或配對的粘性末端連接起來，其作用是修復(fù)DNA分子中斷裂的雙鏈。
在分子生物學(xué)中，它通常用于將限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的DNA片段插入載體。商業(yè)連接酶提供含有ATP和Mg2+的反應(yīng)緩沖液，這兩種物質(zhì)對連接酶活性都是必不可少的。
由于反復(fù)的凍融可能會破壞ATP，所以最好將溶液進行分裝。
鏈接反應(yīng)本身有兩個基本步驟。首先，DNA末端必須偶然碰撞，并保持在一起足夠長的時間，以便連接酶連接它們。
低溫反應(yīng)更容易。所有的分子在更高的溫度下移動得更快，如果它們在低溫下輕輕地漂浮在溶液中，而不是像在更高的溫度下那樣呼嘯而過，那么兩個DNA末端碰撞并保持在一起會更容易。對于粘性末端，較低的溫度穩(wěn)定了互補核苷酸之間的氫鍵，有助于保持性對位置。
第二步是酶促反應(yīng)：DNA連接酶通過兩步催化3′-OH與5′-磷酸基團連接。首先，與酶活性部位的賴氨酸殘基相連的AMP核苷酸被轉(zhuǎn)移到5′-磷酸。然后磷酸腺苷鍵被3′-OH攻擊，形成共價鍵并釋放腺苷酸。為了讓酶進行進一步的反應(yīng)，酶活性部位的AMP必須由ATP補充。
DNA連接酶在25℃時具有最佳活性，因此連接反應(yīng)在使DNA末端連接在一起的最佳溫度（1℃）和酶反應(yīng)（25℃）之間的權(quán)衡溫度下進行。通常在16℃下1小時是可以的，但是由于將DNA末端連接在一起是反應(yīng)中最不有效的部分，因此通過將溫度降低到4℃來促進這一點可以提供更高的效率。 然而，酶在這個溫度下工作非常緩慢，因此需要很長的（如過夜）反應(yīng)時間。
三、比色分析的工作原理
1.對硝基苯基磷酸酯—分析機制
對硝基苯磷酸酯（pNPP）作為一種合成底物廣泛應(yīng)用于各種磷酸酶的催化活性測定。pNPP的磷酸基團被酶裂解生成對硝基苯酚，由于對硝基苯酚在水中電子激發(fā)的最大波長為318nm，因此對硝基苯酚也是無色的。然而，在堿性條件下，對硝基苯酚轉(zhuǎn)化為對硝基苯酚陰離子，導(dǎo)致向400nm左右的深色偏移（根據(jù)溶液條件將化合物的吸收峰改變?yōu)檩^長波長）。這是電磁光譜的藍色邊緣，但是由于我們看到反射光的顏色（與吸收光相反），溶液看起來是黃色的。
要記住的事情：
鉻酸鹽轉(zhuǎn)移是分析的關(guān)鍵因素。
舉例來說，如果酶的活性要求在酸性范圍內(nèi)有一個最佳的pH值，那么酸性磷酸酶的情況正好如此。
在這種情況下，為了獲得所需的黃色，必須在終點添加強堿（例如氫氧化鈉或氫氧化鉀）。
2.孔雀綠—分析機制
對硝基苯磷酸測定是很好的，但是如果你最喜歡的磷酸酶不能有效地代謝pNPP呢？另一種市面上可買到的磷酸酶測定法是孔雀綠測定法。這種簡單的測定方法是基于孔雀綠、鉬酸銨和游離正磷酸鹽（又稱無機磷酸鹽，pi）在酸性條件下形成的絡(luò)合物。
正磷酸鹽被磷酸酶分解后從磷酸化底物中釋放出來，在硫酸溶液中與鉬酸銨形成絡(luò)合物。孔雀綠磷鉬酸鹽絡(luò)合物的形成，在620-650nm處測量，與游離正磷酸鹽濃度直接相關(guān)。因此，有可能量化蛋白質(zhì)磷酸酶底物的磷酸化和磷酸釋放。
要記住的事情：
這種方法僅測量無機游離磷酸鹽；在測量之前，必須首先水解和中和有機磷酸鹽（脂質(zhì)結(jié)合或蛋白質(zhì)結(jié)合磷酸鹽）。了解不同種類的有機磷酸鹽及其各自不同的水解自由能有助于優(yōu)化分析條件。高能有機磷酸酯（縮醛磷酸酯、酸酐等）具有不耐酸的磷酸基團，可在低pH下孵育釋放到溶液中。另一方面，低能有機磷酸鹽（磷酸酯）在酸性溶液中穩(wěn)定，需要更苛刻的條件（如熱分解）才能用這種方法檢測。
在大量孔雀綠存在下，3:1離子締合物[(MG+)3(PMo12O40 3-)]容易在酸性水溶液中形成和沉淀。為了穩(wěn)定水溶液中的1:1離子締合物，在溶液中加入聚乙烯醇。
在分析過程中要考慮的另一件事是任何可能干擾分析的氧化還原反應(yīng)的可能性。鉬是一種過渡金屬，因此存在于多種氧化狀態(tài)。在鉬酸鹽陰離子中，它具有+6的氧化狀態(tài)。通過有機化合物，如抗壞血酸和還原糖（即葡萄糖）或無機化合物（如SnCl2）還原酸化的Mo（VI）溶液，生成顏色為藍色的Mo（IV）物質(zhì)。
四、實驗室級用水是如何純化的？
1.蒸餾：像山丘一樣古老的技術(shù)（或者至少像隱藏在山丘里的靜物一樣）。水被加熱到沸點，然后冷凝成液體。這樣可以除去許多雜質(zhì)，但沸點等于或小于水的雜質(zhì)也會被帶入蒸餾液中。
2.微濾：在這項技術(shù)中，利用壓力迫使水通過孔徑為1至0.1微米的過濾器，以去除顆粒物。直徑小于0.2微米的過濾器可去除細菌，即所謂的冷殺菌。
3. 超濾，使用更小的孔徑（小于0.003微米）。這些基本上都是分子篩，用來去除直徑大于孔徑的分子。它可以用來清除病毒、內(nèi)毒素、核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶。
4.反滲透。反滲透過濾器的孔徑小于0.001微米，這使得它們能夠根據(jù)直徑篩選離子。這是用來脫鹽的水。
5.通過活性炭床過濾，有助于去除吸附在炭表面的氯離子和有機化合物等物質(zhì)。
6.紫外線輻射。紫外線是一種很明顯的去除水中微生物的方法。它還可以通過將某些有機化合物分解成危害較小的產(chǎn)物用來凈化水。
7. 去離子/離子交換。將水通過含有陽離子和陰離子樹脂混合物的樹脂床來去除水中的離子。水中的正離子被陰離子樹脂顆粒所吸引，而負離子被陽離子樹脂所吸引。其結(jié)果是從樹脂床的另一端流出去離子水。
銷售純水水或凈水系統(tǒng)通常將使用這些技術(shù)的組合。水的純度越高，使用的技術(shù)就越多。
五、為什么酶有最適溫度
每個生物學(xué)家都熟悉酶反應(yīng)速率與溫度的關(guān)系，如圖所示。
我們知道來自大腸桿菌或溫血動物的酶在37℃左右有一個最佳溫度，而來自熱排氣細菌的酶有更高的最佳溫度。
為什么酶有一個最佳溫度分布？化學(xué)家有一個經(jīng)驗法則，溫度升高10℃會使反應(yīng)速度加倍。這個規(guī)則是從Arrhenius方程推導(dǎo)出來的。
基本上，隨著溫度的升高，反應(yīng)物的動能也隨之增加。這種動能的增加意味著反應(yīng)物更容易與足夠的能量發(fā)生碰撞，從而使反應(yīng)發(fā)生，因此溫度越高，反應(yīng)速率越高。
溫度上升：反應(yīng)速率曲線的第一部分，其中速率隨著溫度的升高而增加，遵循Arrhenius方程。如果這種酶即使在高溫下也完全穩(wěn)定，反應(yīng)速度也會隨著溫度的升高而繼續(xù)增加，直到發(fā)生其他事情，比如其中一種反應(yīng)物變得受限。
平衡：反應(yīng)速率開始趨于平穩(wěn)，這是由于溫度接近該酶變性溫度（因此失去活性）。
溫度下降：在更高的溫度下，酶完全變性，失活。
變性發(fā)生的溫度取決于酶的結(jié)構(gòu)，而這又與酶的進化起源有關(guān)。大腸桿菌的酶已經(jīng)進化到可以應(yīng)對37℃左右的溫度，而來自熱噴口細菌的酶則被迫進化到可以在更高溫度下保持穩(wěn)定的程度。
因此，酶的最佳溫度是基于Arrhenius模式對溫度的依賴性（反應(yīng)越熱，反應(yīng)速度越快）和酶接近變性溫度時的不穩(wěn)定性之間的權(quán)衡。
