? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)流程
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打開軟件，單擊左上角“File”→“New”→“DNA?Sequence”。
復(fù)制DNA序列到下圖的空白處
復(fù)制時會彈出下面的選擇框，根據(jù)需要進(jìn)行選擇基因的DNA/cDNA序列，在輸入框內(nèi)點(diǎn)擊Ctrl+V鍵，將序列粘貼到對話框中，可以選擇正常（As Is），反向（Reversed），互補(bǔ)（Complemented），反向互補(bǔ)（Reversed Complemented），默認(rèn)為“As Is”，單擊“OK”。
在此界面可以看到，基于這個序列可以進(jìn)行引物設(shè)計(jì)（Primer），限制酶切點(diǎn)分析（Enzyme）和基序查找（Motif），另外還有一個功能是同源性分析（Allign）?！癟ranslation” →“Protein”，可以將核酸序列翻譯成蛋白序列。
其中最常用的功能是引物設(shè)計(jì)，單擊左上角“Primer”
彈出以下頁面，再單點(diǎn)擊“Search”，進(jìn)入引物搜索參數(shù)設(shè)置（Search Criteria）。
引物搜索設(shè)置包括：
? 搜索目的：PCR引物（PCR Primers），測序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridzation Probes）。
? 搜索類型：可選擇上游引物（Sens Primer）搜索，下游引物（Anti-sense Primer）搜索，成對搜索（Pairs），以上游引物為主搜索（Compatible with Sense），以下游引物為主搜索（Comp atible with Anti-sense Primer）。
? 修改搜索范圍（Search Ranges）（Sense Primer：正向引物搜索區(qū)域，Anti-Sense Primer：反向引物搜索區(qū)域，），PCR產(chǎn)物大?。≒CR Product Size）。
? 引物長度（Primer Length），（例子：25bp±4bp）
? 搜索方式：自動搜索（Automatic）和手動搜索（Manual）。
可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，單擊OK。
進(jìn)入Search Progress界面，再單擊OK。
Premier pairs：顯示搜索到的引物對數(shù)量
搜索結(jié)果有上游引物（Sense）、下游引物（Anti-sense）和成對（Pairs）三種方式顯示，默認(rèn)是（Pairs）成對顯示。軟件按引物的評估等級從高到低進(jìn)行排列，當(dāng)前界面可以看到引物的一些簡單參數(shù)，選中某一對引物后，會出現(xiàn)該引物的詳細(xì)信息。
? 點(diǎn)擊“S”（代表上游引物）或“A”（代表下游引物）可以分別查看上下游引物的具體位置信息，右邊顯示為PCR產(chǎn)物的位置。
? 表格部分為上下游引物和產(chǎn)物的一些信息，主要包括評估等級（Rating）、長度（Length）、Tm值（Tm）、GC含量（GC%）等。 ΔG（ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了引物與模板結(jié)合的強(qiáng)弱程度。一般情況下，引物的ΔG最好呈現(xiàn)正弧曲線形狀，應(yīng)當(dāng)選用3’端ΔG值較低（絕對值不超過9））。其他可以忽略。
? 下方為上下游引物的一些重要指標(biāo)分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin），二聚體（Dimer），錯誤引發(fā)情況（False Priming），引物二聚體（Cross Dimer）。“None”代表所分析的引物不存在對應(yīng)結(jié)構(gòu)的形成，“Found”代表所分析的引物存在對應(yīng)結(jié)構(gòu)的形成，點(diǎn)擊“Found”可以查看該結(jié)構(gòu)的形成情況。
還可以查看單個引物的信息并進(jìn)行調(diào)整。
點(diǎn)左邊的S，代表Sense正向，再點(diǎn)Edit Primers。
Edit Primer 框中會顯示引物位置、附近的酶切位點(diǎn)、以及其他信息。右鍵復(fù)制即可復(fù)制該條引物?？筛鶕?jù)相關(guān)信息，在紅框中調(diào)整引物序列。
反向引物的微調(diào)同上。
點(diǎn)擊File>Print>Current Pair ,
彈出如下窗口，在Print中可以選擇上游引物（SensePrimer）或者下游引物（Anti-sensePrimer）或者成對（Primer Pairs），在Secondary Structures（蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)）中選擇Most Stable（穩(wěn)定結(jié)構(gòu)）或者All（所有結(jié)構(gòu)），Secondary Structures針對的時粘貼的為蛋白序列來說的，引物設(shè)計(jì)不涉及，可忽略（對于DNA序列的引物設(shè)計(jì)，點(diǎn)擊Most Stable或者All都可以，兩者最終輸出的結(jié)果無差異）。然后點(diǎn)擊Print。
點(diǎn)擊Print后，出現(xiàn)如下對話框，可以選擇直接打印或者輸出為PDF。點(diǎn)擊確定。
輸出為PDF結(jié)果如下
點(diǎn)擊File>Print>Print Search Results，
彈出如下窗口，
在紅色方框1：Print中可以選擇上游引物（SensePrimer）或者下游引物（Anti-sensePrimer）或
者成對（Primer Pairs）；
在紅色方框2：Table（表示輸出表格），Sequence（表示輸出序列），Both（表示輸出表格和序列）；
在紅色方框3：Marked（表示輸出表格勾了√的引物對的信息），All（表示輸出表格中所有引物對的信息）；
然后點(diǎn)擊Print。
結(jié)果輸出如下：
