研究背景：
特發(fā)性肺纖維化(IPF)是一種尚未明確發(fā)表機制的肺病。近年來，IPF的發(fā)病率隨時間增加。壞死性凋亡是一種促炎型的程序性細胞死亡，可促進細胞內容物的釋放以激活免疫反應。近年來，免疫浸潤一直是癌癥研究領域的熱點。多種免疫細胞在肺纖維化過程中起重要作用。
關于非腫瘤生信，我們也解讀過很多，主要有以下類型
1 單個疾病WGCNA+PPI分析篩選hub基因。
2 單個疾病結合免疫浸潤，熱點基因集，機器學習算法等。
3 兩種相關疾病聯(lián)合分析，包括非腫瘤結合非腫瘤，非腫瘤結合腫瘤或者非腫瘤結合泛癌分析
4 基于分型的非腫瘤生信分析
5 單細胞結合普通轉錄組生信分析
目前非腫瘤生信發(fā)文的門檻較低，有需要的朋友患者歡迎交流
流程圖：
研究結果：
一、IPF與對照間DEG和壞死性凋亡相關DEG（NRDEG）的鑒定
1、差異分析前對GSE110147中的IPF組和對照組進行主成分分析(PCA)，發(fā)現(xiàn)兩組之間具有明顯的可比性。
2、圖2A描繪了PCA的結果。隨后，通過差異分析發(fā)現(xiàn)GSE110147中IPF和對照組之間有3253個DEGs。
3、圖2B通過熱圖的可視化顯示了DEGs的表達。壞死性凋亡相關基因與GSE110147中的DEGs重疊，進一步分析29個重疊的NRDEGs。
4、圖2C以維恩圖顯示29個NRDEGs。
5、通過熱圖和火山圖來顯示NRDEGs的表達，如圖2D, E。
二、PPI網絡及功能通路分析
1、從STRING數(shù)據庫構建NRDEGs的PPI網絡(圖3A)。
2、基于CytoHubba MCC的算法被用來識別前10個樞紐基因(圖3B)，包括CFLAR、BIRC2、BIRC3、CYLD、TRAF5、IL1B、STAT1、INFAR1、TICAM1和NLRP3。
3、對NRDEGs進行GO和KEGG富集分析，確定其生物學功能和相關信號通路(圖4A、B)。
4、在分子功能中也發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子受體超家族結合、參與凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性和細胞因子受體結合的富集(圖4C)。
5、KEGG分析顯示，NRDEGs富集于壞死性凋亡NOD樣受體信號通路、TNF信號通路、甲型流感、新型冠狀病毒肺炎、單純皰疹病毒1型感染、脂質和動脈粥樣硬化、C型凝集素受體信號通路、丙型肝炎(圖4D)。
三、免疫浸潤及NRDEGs與免疫細胞的相關性
1、通過富集分析，觀察到NRDEGs主要與免疫相關信號通路相關。
2、利用ImmuCellAI算法研究了IPF中程序性壞死和免疫浸潤之間的關系。結果顯示IPF組和對照組之間有12種免疫細胞類型存在顯著差異(圖5A-D)。
3、spearman相關性檢驗結果顯示，NRDEGs主要與巨噬細胞和中性粒細胞浸潤呈正相關，與DC細胞和NK細胞浸潤呈負相關，通過相關熱圖可以直觀顯示(圖5E)。
四、研究NRDEGs在肺纖維II型肺泡上皮細胞中的表達
1、為了進一步探索IPF中程序性壞死與細胞類型的關系，提取了GSE122960的單細胞測序數(shù)據進行分析。
2、在AT II中觀察到4831個差異表達基因。篩選出31個重疊的NRDEGs，包括MLKL、IFNAR1和TRAF5。圖6A顯示了維恩圖可視化中的31個NRDEGs。
3、通過火山圖觀察NRDEGs的表達情況，如圖6B所示。
四、預后相關樞紐基因的鑒定及預后預測模型
1、GSE70866包含176例IPF患者的測序數(shù)據，sva包消除了批次效應。去除效果以PCA圖表示(圖7A, B)。
2、提取樞紐基因和預后數(shù)據的表達矩陣，KM曲線顯示單因素Cox回歸分析得到的生存差異基因(圖7C-F)。
3、多因素cox回歸顯示IFNAR1、TRAF5、NLRP3、CYLD與預后相關。結果以森林圖的形式顯示(圖8)。作者基于多因素cox回歸的結果構建了預后模型
4、預后模型分析顯示，與低危組相比，高危組的預后明顯更差(圖9A)。
5、該生存評估模型對IPF患者預后具有較好的預測價值，AUC為0.708(圖9B)。
6、本研究還基于Cox模型建立了總生存預測列線圖(圖9C)。
五、NRDEGs表達及預后預測模型效果的驗證
1、通過對GSE213001的分析，共發(fā)現(xiàn)27個相同的NRDEGs。27個NRDEGs中有12個基因的表達趨勢與GSE110147一致，包括BIRC2、BIRC3、CYLD、DNM1L、HSP90AA1、IL1B、NLRP3、PLA2G4A、PLA2G4F、PYCARD、RBCK1和TRAF5(圖10A、B)。
2、在外部數(shù)據集GSE93606中進一步驗證了預后預測模型的效果。根據風險評分將IPF患者分為高危組和低危組。在GSE93606中，生存比較顯示低危組的預后明顯優(yōu)于高危組(圖10C)。
六、壞死性凋亡相關預后基因表達的初步驗證IPF A549細胞模型
1、對以往肺纖維化單細胞測序數(shù)據集的分析表明，壞死性凋亡與AT II密切相關。
2、qPCR結果顯示，CYLD、NLRP3、IFNAR1和TRAF5在TGF-b處理組中高表達，而在對照組中低表達。CYLD和TRAF5在對照組和IPF組之間的表達差異有統(tǒng)計學意義(圖11)。
七、博萊霉素誘導肺纖維化小鼠模型預后基因表達的驗證
1、為了進一步驗證體外細胞實驗結果，盡可能模擬肺纖維化患者的病理過程，成功構建了博萊霉素誘導肺纖維化小鼠模型進行體內實驗。
2、Western blot結果顯示，壞死標志物p-MLKL和4個與壞死相關的預后基因CYLD、NLRP3、TRAF5、IFNAR1在博來霉素誘導的小鼠肺組織中高表達(圖12A、B)。
3、HE和Masson染色結果顯示，與對照組相比，博來霉素組肺組織炎癥和膠原沉積明顯增加(圖12C)。
總結：
程序性壞死相關信號通路在IPF中大量富集。本文共篩選出29個NRDEGs，其中12個在GSE213001中表達趨勢一致。Spearman相關性分析顯示，NRDEGs表達與促炎免疫細胞浸潤呈正相關，與抗炎免疫細胞浸潤呈負相關。包括MLKL在內的NRDEGs在纖維化肺組織AT II中高表達。通過cox逐步回歸構建4個NRDEG的壞死性凋亡相關預測模型。在驗證數(shù)據集GSE93606中，預后預測模型顯示出良好的適用性。程序性壞死在IPF中存在，并可能在ATII期發(fā)生。程序性壞死與免疫浸潤相關，提示ATII程序性壞死可能通過激活免疫浸潤和免疫應答參與IPF的發(fā)生。
