文獻信息
標題：Characterizing single extracellular vesicles by droplet barcode sequencing for protein analysis
DOI(url): https://isevjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12277
日期及雜志：2022 Nov, J Extracell Vesicles
作者及單位：Mahsan Banijamali
文獻概述(這篇文獻的結(jié)論是什么？)
近年來，小細胞外囊泡(Small extracellular vesicles, sEV)已發(fā)展成為疾病診斷和治療隨訪的生物標志物來源。來自多細胞生物的sEV樣品顯示出高度異質(zhì)性的囊泡庫，這是目前基于集成測量的方法無法捕獲的。在這項工作中，我們提出了用于蛋白質(zhì)分析的液滴條形碼測序(DBS-Pro)來分析單個sEV的表面蛋白，從而促進樣品內(nèi)和樣品間sEV亞型的鑒定。該方法允許通過使用DNA條形碼親和試劑和測序作為readout分析多種蛋白質(zhì)。高通量單囊泡分析是通過在乳化液液滴中對單個sEV進行區(qū)隔，然后通過PCR對液滴進行條形碼分析實現(xiàn)的。在這個概念驗證研究中，我們證明了DBS-Pro允許分析單個sEV，混合率低于2%。從非小細胞肺癌細胞系和非小細胞肺癌患者的惡性胸腔積液(MPE)液中獲得的總共超過120,000個sEV根據(jù)其表面蛋白進行了分析。該方法實現(xiàn)了單囊泡表面蛋白圖譜和sev亞型的擴展表征，這對于在異質(zhì)樣本中識別囊泡的細胞起源至關(guān)重要。
文獻結(jié)果(每個結(jié)果的圖片詳細解讀)
1、蛋白分析液滴條形碼測序(DBS-Pro)法原理
圖1描述了用于蛋白質(zhì)分析的液滴條形碼測序(DBS-Pro)的概念，以及sEV在單囊泡分辨率下的定量蛋白質(zhì)分析。囊泡用含有抗體特異性條形碼(antibody-specific barcode, ABC)和UMI的寡核苷酸偶聯(lián)抗體進行標記。用霍亂毒素亞基B (CTB)覆蓋的磁珠捕獲帶有抗體標記的囊泡，進行洗滌，然后被封裝在含有獨特的液滴條形碼(DBC)序列的乳化液液滴中。在每個液滴中，ABC和DBC通過重疊延伸被放大和連接。對所得文庫進行測序，并對單個囊泡的表面蛋白進行鑒定和定量。
2、單囊泡檢測的驗證
為了研究和驗證DBS-Pro法對單個囊泡的檢測(圖1)，本文使用從NSCLC細胞系H1975的細胞培養(yǎng)基中收集的sEV進行了一系列hashing experiments(圖2A)。兩組不同的條形碼寡核苷酸被用來標記CD9和EGFR抗體。在bead hashing中，囊泡與兩組在不同的反應(yīng)管中孵育，并分別捕獲，并在形成液滴之前混合。在EV hashing中，囊泡與兩組在不同的反應(yīng)管中孵育，但在它們被捕獲之前進行混合。(圖2B)顯示了bead hashing(n = 2)和EV hashing(n = 3)的Single set和混合速率。如果95%或更多的UMI只屬于一個集的ABC，則認為液滴是Single set的。(圖2C)顯示基于每個單個囊泡的UMI計數(shù)的Single set和混合液滴。hashing experiments清楚地表明，DBS-Pro在至少98%的液滴中以單個囊泡分辨率生成數(shù)據(jù)。
3、DBS-Pro用于非小細胞肺癌細胞系sEV多重蛋白分析的驗證
為了研究該技術(shù)分析單個sEV上多個目標蛋白的潛力，本文使用11種蛋白進行了一系列DBS-Pro實驗。在培養(yǎng)的非小細胞肺癌H1975細胞株H1975_1、H1975_2和H1975_3三個時間點的培養(yǎng)基中分離sev進行平行實驗。測序結(jié)果顯示，H1975_1、H1975_2和H1975_3的單囊泡分別為8943個、10054個和30350個。(圖3A)熱圖顯示基于log2轉(zhuǎn)換后UMI總數(shù)的數(shù)據(jù)。(圖3B)熱圖顯示含有液滴的比例。(圖3C)小提琴圖顯示了每個液滴的UMI計數(shù)分布。(圖4D)表示含有至少三個蛋白的液滴前兩個主成分(PCs)散點圖，沿各軸表示相對樣本密度，表明樣本之間有很好的重疊。
4、非小細胞肺癌患者惡性胸腔積液單個囊泡的表面蛋白譜分析
在確定DBS-Pro能夠?qū)蝹€sev的表面蛋白進行多重檢測后，本文應(yīng)用該方法對從不同腫瘤基因組改變的晚期NSCLC患者(PE002、PE009和PE011)的MPE液中收集的單個sev進行蛋白譜分析。DBS-Pro法在PE002、PE009和PE011樣品中分別檢測到9064、11920和4565個單囊泡。(圖4A)中的熱圖顯示了每個蛋白在DBC總數(shù)中的比例。結(jié)果表明，來自所有三種MPE樣品的sEV具有相對較高的CD9表達。(圖4B)顯示前30個蛋白組合占條形碼總數(shù)的比例。(圖4C)表示所有樣品的單個囊泡的UMAP降維結(jié)果，被分為了6個cluster。(圖4D)堆疊柱狀圖顯示了每個MPE樣本中sEV的相對比例。(圖4E) PE002、PE009和PE011樣品單個囊泡的UMAP圖，顯示每個樣品的密度。(圖4F)熱圖顯示了每個蛋白的相對表達。每一列代表一個液滴(即一個囊泡)。
文獻方法(使用的生物信息學(xué)方法)
測序FASTQs使用DBS-Pro pipeline(https://github.com/FrickTobias/DBS-Pro, v0.3)處理。從讀取的每個序列中，分別使用cutadapt提取DBC和ABC+UMI組合。DBC序列通過starcode聚類進行糾錯，編輯距離為2(參數(shù)' -d 2 ')。利用cutadapt與樣品中使用的已知ABC序列進行比較，從每個ABC+UMI組合中確定目標(ABC)。對于每個校正的DBC和已識別的ABC，使用UMI-tools校正UMI序列。最后，對每個校正后的DBC、ABC和UMI組合的read count進行匯總。
數(shù)據(jù)過濾。首先，為了去除背景和嵌合產(chǎn)物，只保留有一個以上讀取的UMI，過濾掉只有一個UMI的DBC。為了去除攜帶多個DBC的液滴，使用Jaccard索引比較了UMI序列的成對重疊。任何Jaccard索引大于0.5的DBC對都被刪除。對于來自H1975細胞培養(yǎng)基和MPE樣本的sEV，也去除了含有超過25個UMIs的DBC。從過濾的數(shù)據(jù)中生成一個計數(shù)矩陣，其中包含每個DBC和ABC的UMI數(shù)量。
使用python包matplotlib, pandas, numpy, and seaborn畫圖。UMAP和PCA 使用scanpy。首先，對液滴進行過濾，只保留有3個或更多蛋白的液滴。然后使用蛋白水平上的中心對數(shù)比(CLR)變換對每個樣本的技術(shù)矩陣進行歸一化。UMAP參數(shù)n_neighbors = 100, min_dist = 0.9, 分辨率0.6。
文章亮點(這篇文獻的優(yōu)點在哪？)
本文作為概念驗證研究邏輯非常清晰，首先驗證該方法是否能夠得到單個囊泡水平的數(shù)據(jù)，然后驗證了該方法在單個囊泡水平上能夠分析多個表面蛋白，最后分析了非小細胞肺癌患者惡性胸腔積液的單囊泡表面蛋白譜作為例子
這個方法可以進行更多蛋白的良好擴展
我的疑問(這篇文獻的不足在哪？)
- 缺乏和同類型技術(shù)的比較
和我相關(guān)(我從這篇文獻里學(xué)到了什么？)
可以通過圖4B以及其他進一步的研究進一步探尋常見的蛋白組合模式
本文的原理與PBA類似，實驗方法上與PBA略有不同，使用emPCR相較于PBA的滾環(huán)復(fù)制，暫時沒有看到具體的數(shù)據(jù)，根據(jù)這個數(shù)據(jù)過濾情況判斷,感覺這篇文章產(chǎn)生的數(shù)據(jù)要比PBA好一點
