作者：馬可菠蘿
審稿：童蒙
編輯：angelica
多細胞生物僅僅由單個細胞發(fā)育而來的整個生物學過程令人震撼。經(jīng)典的譜系追蹤實驗已經(jīng)用于追蹤線蟲單細胞到多細胞的發(fā)育過程，并發(fā)現(xiàn)了細胞譜系和表型方面的差異。但更復雜的生物體是如何精妙地調(diào)控細胞的發(fā)育過程仍不清楚。
背景介紹
線蟲作為一種模式生物，其細胞發(fā)育的過程已經(jīng)被研究地較為透徹，但高等生物尤其是哺乳動物中細胞的發(fā)育過程異常復雜，沒有很好的工具來記錄細胞發(fā)育的大跨度發(fā)育過程。
目前，以CRISPR-Cas9為基礎(chǔ)的技術(shù)已被用于記錄細胞譜系發(fā)生，整合scRNA測序技術(shù)揭開了胚胎發(fā)育神秘的面紗。然而這些研究的barcode缺乏多樣性，很大程度上限制了在其他生命體中的應用。
為了進一步揭開哺乳動物早期胚胎發(fā)育過程，作者基于CRISPR-Cas9技術(shù)開發(fā)了一套細胞譜系追蹤記錄器，為小鼠原腸胚發(fā)育過程的研究提供了可用的工具。
分子追蹤器的設(shè)計原理
理想的多細胞生物發(fā)育分子追蹤器需要滿足以下要求：
對細胞表型方面的影響要降到最低
能夠記錄數(shù)以萬計細胞的高通量信息
能夠同時分析單細胞的功能信息
可記錄大尺度時間線上的變化
在整個實驗過程中連續(xù)產(chǎn)生多樣性用于研究
01.追蹤器模型
首先設(shè)計包含熒光蛋白的分子追蹤器模型，驗證追蹤器模型的可行性。
靶點設(shè)計
a. 合成的靶點包含3個切割位點
b. 包含8 bp整合的barcode
c. 連接于熒光蛋白的3`非編碼區(qū)
sgRNAs
使用Cas9產(chǎn)生雙鏈斷裂修復后造成可遺傳的插入或者缺失突變。用于記錄信息的是包含3個切割位點以及8堿基對的“整合條碼”205個堿基對的合成DNA。該合成DNA序列被嵌入組成型轉(zhuǎn)錄的熒光蛋白3`非翻譯區(qū)，從而能夠通過熒光從轉(zhuǎn)錄組中分析實驗結(jié)果。另外一個cassette編碼了三個guide RNA，可用來記錄多種信號。
02.分子追蹤器評估
基于構(gòu)建好的分子追蹤器模型來進行切割實驗和性能驗證。
此基因編輯系統(tǒng)能夠產(chǎn)生大量的可遺傳修復結(jié)果和目標位點，并且可以通過整合條碼對這些序列進行區(qū)分。
為了篩選能夠控制突變比例的序列，用于長期時間的試驗切割，鏈接GPF報告基因，通過對含報告基因的細胞的比例進行統(tǒng)計（20天的大跨度）。
sgRNA中的突變（單和雙突變）設(shè)計在了前間區(qū)序列鄰近基序（PAM）的附近，這些guide RNA是作者通過篩選得到的，使用GFP報告基因在超過20天的時間對guide RNA靶標的活性進行監(jiān)控，從而篩選具有廣泛動態(tài)變化范圍的序列。
03.構(gòu)建Cas9-GFP載體
分子追蹤器模型驗證有效后，進行載體構(gòu)建和單細胞培養(yǎng)實驗。
開展小鼠細胞實驗，將多個靶點整合到基因組中之后，又將組成型的Cas9-GFP編碼的精子釋放到卵母細胞之中啟動切割，收集E8.5-E9.5胚胎用于下游分析。
04.建庫測序流程
基于10x Genomics平臺的建庫測序流程示意圖：
為了證明該技術(shù)的譜系追蹤能力，他們對于胎盤、卵黃囊以及胚胎局部組織（3小份）中的靶點進行擴增，并且通過插入、缺失標記的相似性來研究這三者之間的關(guān)系，從而評估該技術(shù)的實用性。
05.分配細胞表型
基于細胞表型數(shù)據(jù)對單細胞進行分配，得到組織層面的單細胞分類結(jié)果。
通過細胞形態(tài)表達特征分配細胞，只展示第2號胚胎（1 of 7），共注釋了22,264細胞，能將細胞進行很好的分類。
06.組織maker基因
基于已知的maker基因?qū)渭毎M行分類和注釋。
該圖展示了典型的組織marker基因，按照不同的胚層進行分類（marker陽性細胞減少），但是特異性較高。
點的大小代表marker基因陽性的細胞比例，顏色代表歸一化的表達量（cluster mean值）。
Ecto：胚胎外胚層；EEcto：胚外外胚層；EEndo：胚外內(nèi)胚層；endo：胚胎內(nèi)胚層；meso:胚外中層; EMeso: 胚外中胚層; PGC: 原始生殖細胞; NMPs: neuromesodermal progenitors。
07.單細胞譜系重建
基于插入、缺失標記多態(tài)性構(gòu)建細胞譜系的進化樹，來構(gòu)建細胞發(fā)育的過程。
（1）譜系進化樹的構(gòu)建
基于InDel加權(quán)l(xiāng)og-likelihoods值，構(gòu)建譜系進化樹，并將細胞類型信息疊加進行標記，從進化樹的根部到分支可以發(fā)現(xiàn)細胞類型是逐漸特化的。其中，每一個分支代表一個InDel生成事件。
（2）單細胞排序策略
通常來說軌跡分析常用于細胞排序，本文使用改良后的漢明距離來評估成對細胞間的譜系距離。
基于單細胞測序結(jié)果建立系統(tǒng)發(fā)育樹后發(fā)現(xiàn)，細胞譜系發(fā)育距離越近，轉(zhuǎn)錄譜的相似度越高，該結(jié)果與細胞在發(fā)育過程中逐漸分化成特化的細胞類型相一致。
08.單細胞狀態(tài)和譜系不一致
經(jīng)過分析，部分單細胞的真實來源與譜系分析結(jié)果并不一致。
胚外內(nèi)胚層 (EEndo)和胚胎內(nèi)胚層 (Endo)分別起源于下胚層和上胚層，但祖源打分很高。
Endo和EEndo祖源打分很高說明兩組細胞很來源一致，但是其真正起源卻截然不同。原因是部分Endo細胞被分配給了EEndo分支。
EEndo：胚外內(nèi)胚層；Endo：胚胎內(nèi)胚層. n: 細胞數(shù)目
分離Endo胚胎內(nèi)胚層譜系細胞，繪制譜系樹，發(fā)現(xiàn)部分細胞中Trap1a和Rhox5（EEndo標記基因）高表達。其他的胚胎中均發(fā)現(xiàn)這個現(xiàn)象。
09.細胞圖譜定量
對不同類型的胚胎組織細胞進行譜系追蹤溯源和比例計算，從而對細胞發(fā)育圖譜過程中各種細胞類型進行定量。
圖a：起源于多能祖細胞的組織分布比例，多能細胞形成所有的胚層，但對不同的細胞命運表現(xiàn)出不對稱的傾向。（灰色的為node，星號標記，生成原始生殖細胞），橫軸是譜系（n為細胞數(shù)目）圖b：灰點代表胚胎，連線連接著相同胚胎的估計。
Epi：上胚層；TE：滋養(yǎng)內(nèi)胚層；全能性細胞發(fā)育成胚胎的所有細胞，包括TE、EEndo、Epi。從左到右為發(fā)育過程。
10.全文總結(jié)
一、開發(fā)了基于CRISPR-Cas9的工具用于追蹤細胞發(fā)育進程
二、實現(xiàn)了哺乳動物原腸胚形成過程細胞命運譜系示蹤
三、實現(xiàn)較長時間跨度下各發(fā)育階段的細胞狀態(tài)追蹤和定量
四、可用于構(gòu)建哺乳動物整個發(fā)育時期細胞命運圖譜
參考文獻
Chan, M.M., Smith, Z.D., Grosswendt, S. et al. Molecular recording of mammalian embryogenesis. Nature 570, 77–82 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1184-5
