ChIP-seq：利用染色質(zhì)免疫共沉淀 + 高通量測序研究某種蛋白質(zhì)結(jié)合的基因組區(qū)域

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1. 甲醛交聯(lián)：將所有蛋白和其結(jié)合的DNA固定下來

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2. 染色質(zhì)片段化：裂解細(xì)胞、DNA超聲打斷成小片段（~300bp）

3. 免疫共沉淀：利目標(biāo)蛋白對應(yīng)的抗體，吸附我們想要的片段形成抗體-蛋白-DNA復(fù)合物，洗脫不想要的

4. 目標(biāo)片段富集：將抗體-蛋白從DNA上解離下來，洗脫抗體-蛋白，獲得DNA片段

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5. 文庫構(gòu)建：測序

A. DNA兩端加adaptor
B. PCR擴增
C. 檢查library concentration
D. 測序

6. 數(shù)據(jù)質(zhì)控+比對到參考基因組

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7. 確定peaks

第一行：參考基因組
第二行：樣本reads覆蓋情況
第三行：control reads覆蓋情況

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參考：
https://www.bilibili.com/video/av54898325?from=search&seid=16669728483429689132
http://www.itdecent.cn/p/a17f2870addd

由于ChIP-Seq實驗過程中的甲醛交聯(lián)、染色質(zhì)片段化、免疫共沉淀以及文庫構(gòu)建等步驟繁瑣且條件難以控制，常規(guī)ChIP-Seq實驗需要大量細(xì)胞，且實驗重復(fù)性差、信噪比低。往往辛苦培養(yǎng)了很久的細(xì)胞，揮霍一空后得到大量難以分析的數(shù)據(jù)，再次實驗又得到一堆不同的無意義數(shù)據(jù)，甚至一個技術(shù)熟練的博士消耗大半年的時間毫無進展。這些技術(shù)上的困難限制了ChIP-Seq在DPI研究中的進一步應(yīng)用，阻礙了表觀基因組等領(lǐng)域的發(fā)展。

CUT&Tag技術(shù)

前不久，弗雷德哈欽森癌癥研究中心的Henikoff博士在Nature Communication公開了CUT&Tag技術(shù)的詳細(xì)結(jié)果與實驗方案。與以往的ChIP-Seq、pA-MNase等方法相比，CUT&Tag技術(shù)方法簡便易行，信噪比高，重復(fù)性好，需要的細(xì)胞數(shù)量少至60個細(xì)胞，且有望將ChIP-Seq做到單細(xì)胞水平。

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CUT&Tag技術(shù)的基本原理為：在抗體引導(dǎo)下，ChiTag酶僅在目的組蛋白修飾標(biāo)志、轉(zhuǎn)錄因子或染色質(zhì)調(diào)控蛋白結(jié)合染色質(zhì)的局部進行目的DNA的片段化，同時添加測序接頭，并釋放到細(xì)胞外。由于絕大部分無關(guān)的染色質(zhì)還留在細(xì)胞核內(nèi)，因此整個實驗的信噪比大幅提高，同時簡化了實驗步驟。該方法可一管式高通量應(yīng)用，并可與單細(xì)胞測序平臺“無縫”結(jié)合。ChiTag酶在打斷基因組的同時加上接頭，不需要繁瑣的補平加A加接頭，在一天內(nèi)可以完成從細(xì)胞到測序文庫制備全流程。

CUT&Tag和ChIP-seq比較：

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和單細(xì)胞測序結(jié)合：
由于PCR之前的反應(yīng)都在細(xì)胞內(nèi)進行，Henikoff博士通過分配單個細(xì)胞到5184納米孔，再加入帶隨機標(biāo)簽的引物進行擴增的辦法，實現(xiàn)單細(xì)胞測序。

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https://www.nature.com/articles/s41467-019-09982-5
https://www.sohu.com/a/331749726_120054289

附：CUT&Tag 實驗操作流程

ConA磁珠沉淀細(xì)胞可用低速離心代替。低速離心指600 × g離心3min，快速離心指<100 × g離心3s。

1. 細(xì)胞預(yù)處理（0.5-1h）
   1.1 室溫下收集新鮮細(xì)胞置于EP管中并計數(shù)；低速離心，去溶液；
   1.2 管中加入細(xì)胞穿孔緩沖液重懸細(xì)胞；低速離心，去溶液；
   1.3 管中加入細(xì)胞穿孔緩沖液再重懸細(xì)胞，輕柔震蕩并滴加Binding 緩沖液重懸的ConA磁珠，輕柔顛倒混勻5-10min；

2. 一抗結(jié)合目的蛋白（2h）
   2.1 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架上沉淀細(xì)胞，去溶液。
   2.2 EP管中加入預(yù)冷的抗體緩沖液將細(xì)胞重懸，輕柔震蕩后置于冰上;
   2.3 每管中加入0.5-1μl一抗（抗體使用生產(chǎn)商推薦濃度），輕柔震蕩；
   2.4 室溫下將EP管置于搖床上孵育2h；

3. 二抗結(jié)合一抗（1h）
   3.1 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
   3.2 將二抗1:100稀釋于穿孔緩沖液，加入管中，輕柔震蕩；
   3.3 室溫下將EP管置于搖床上孵育30-60min；
   3.4 快速離心細(xì)胞，將管蓋液體離心下來，EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
   3.5 管中加入0.8-1ml 穿孔緩沖液，上下顛倒10次；
   3.6 重復(fù)步驟3.4、3.5兩次。

4. ChiTag轉(zhuǎn)座體結(jié)合抗體（1.5h）
   4.1 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
   4.2 將ChiTag轉(zhuǎn)座體1:250稀釋于穿孔緩沖液2中，并滴加于細(xì)胞上，輕柔震蕩；
   4.3 室溫下將EP管置于搖床上孵育1h；
   4.4 快速離心細(xì)胞，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
   4.5 管中加入0.8-1ml穿孔緩沖液2，上下顛倒10次；
   4.6 重復(fù)步驟4.4、4.5兩次。

5. 激活ChiTag轉(zhuǎn)座體，片段化目的DNA（1h）
   5.1 快速離心EP管，將管蓋液體離心下來，將EP管靜置于磁力架沉淀細(xì)胞，去溶液。
   5.2 管中加入300μl ChiTag激活緩沖液，輕柔震蕩；
   5.3 37oC孵育1h。

6. DNA提?。?h）

7. PCR（1h），PCR之前需加入72oC，5min步驟

8. DNA純化（30min）

9. 上機測序