????????游離RNA(cell-free RNA，cfRNA)是指存在于體液中細(xì)胞外的內(nèi)源性或外源性RNA，包括mRNA、lncRNA和miRNA等。其中血漿游離mRNA、lncRNA由于攜帶豐富的信息，逐漸成為液體活檢的重要組成部分。想要高效又高質(zhì)量的提取出血漿游離RNA，我們要搞清楚血液來源樣本的類型有哪些，血漿游離RNA提取方法如何選擇，試劑盒的選擇標(biāo)準(zhǔn)是怎樣的？
一、什么是外周血，什么是全血，什么是血清，什么是血漿？
????????新鮮的血液（也叫全血，醫(yī)學(xué)上稱為外周血）加入抗凝劑（如檸檬酸鈉，EDTA等，一般醫(yī)院采血都是用抗凝管采集），靜置一段時間，會出現(xiàn)分層的現(xiàn)象。上面淡黃色的半透明液體是血漿，約占55%，下面暗紅色不透明的是紅細(xì)胞，約占45%。中間薄薄的一層白色物質(zhì)是白細(xì)胞和血小板，不到1%。紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板共同組成了血細(xì)胞。
????????特別提示：不加抗凝劑的血液很快就會凝成血塊，在凝血塊周圍出現(xiàn)的淡黃色的透明液體是血清，血清中不含纖維蛋白原。
????????簡單來說，全血包括血漿和血細(xì)胞（紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板），血漿包括血清和纖維蛋白原。
二、血漿游離RNA含量過少，選擇何種方法提??？
????????常用的血漿游離RNA提取方法主要有酚-氯仿法、硅膠磁珠吸附法(磁珠法)以及硅膠膜吸附柱法(柱式法)，其中酚-氯仿法由于其毒性大、提取效率低、重復(fù)差等特點并不適宜用于血漿游離RNA提取。目前主要用于血漿游離RNA提取的方法以磁珠法和柱式法為主。由于提取原理上的缺陷，磁珠法的提取富集度和靈敏度遠(yuǎn)不如離心柱法，而即使是離心柱法，目前也存在富集倍數(shù)偏低的問題。但要獲得大量高濃度的游離RNA，柱式法是目前唯一的選擇。一些生物公司如Qiagen、Takara、Starvio等都研發(fā)出了比較不錯的血漿游離RNA提取產(chǎn)品。
三、血漿游離RNA試劑盒的選擇標(biāo)準(zhǔn)？
1) 較高的提取得率
????????在實驗試劑的選擇中，如果選擇不謹(jǐn)慎，很有可能導(dǎo)致提取的RNA濃度過低將無法進(jìn)一步分析，如基因克隆、基因檢測、微生物核酸檢測、測序、分子雜交等，所以選擇正確的試劑非常關(guān)鍵，可以直接提高實驗的成功率。Qiagen、Takara、Starvio等公司都具有較為先進(jìn)的技術(shù)，可使血漿游離RNA獲得較高的提取得率。其中，國內(nèi)Starvio所研發(fā)的血清血漿游離RNA提取試劑盒（中提）可高效富集提取液體樣本中的低豐度游離RNA，較普通試劑盒的提取濃度大幅提升3倍以上，有效克服了一般試劑盒樣本量大、洗脫液多、RNA 提取終濃度依然較低的缺點，可廣泛用于Northern雜交、RT-PCR、Real Time RT-PCR、cDNA 文庫構(gòu)建、測序等各種常規(guī)分子生物學(xué)實驗。
2) 提取的RNA純度高
核酸純度一般根據(jù)A260/A280比值來判斷。A260/A280是指DNA或RNA在260nm處的吸光值與在260nm處的吸光值的比值，用來表示DNA或RNA的純度的。純RNA的A260/A280=2.0。當(dāng)樣品被蛋白質(zhì)或者酚污染的話，A260/A280值會下降。RNA樣品被DNA污染的話，A260/A280值會下降。
????????使用國外Q公司血漿RNA提取試劑盒提取的血漿RNA，A260/A280一般在1.8-1.9之間；使用STARVIO血清血漿游離RNA提取試劑盒（中提）提取的血漿RNA，A260/A280一般在1.8-2.0之間，使用T公司血漿RNA提取試劑盒提取的血漿RNA，A260/A280比值在1.7-1.9之間。Q公司提取RNA的純度似乎優(yōu)于國產(chǎn)試劑，但我們提取的RNA是用于PCR檢測，結(jié)果并無明顯影響。可能因為Starvio公司血清血漿游離RNA提取試劑盒（中提）提取的血漿RNA得率較高的原因，同樣的RNA加樣體積（2uL），Starvio試劑盒提取的RNA熒光定量PCR檢測結(jié)果CT值要優(yōu)于Q公司試劑盒提取的RNA。
3)操作簡便性
就我們曾經(jīng)用過的以上三種提取試劑盒來說，Q公司的血漿RNA提取試劑盒提取過程大約35min，從樣本處理開始需要個13步驟；T公司血清/血漿游離RNA提取試劑盒整個提取過程需要約50min，從樣本開始處理11個步驟；Starvio公司的血清血漿游離RNA提取試劑盒（中提）提取過程大約25min，從樣本開始處理10個步驟?？梢奡tarvio公司的血漿游離RNA提取試劑盒（中提）在操作簡便性上具有一定優(yōu)勢，更適合于較多樣本的檢測。
