? ? 首先來談一下免疫組織化學(xué)（IHC, Immunohistochemistry）、免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC, Immunocytochemistry）和免疫熒光(IF, immunofluorescence technic)的共通之處和區(qū)別。
? ? 平常說的免疫組化就是用石蠟切片做的免疫組織化學(xué)，樣品是經(jīng)過甲醇或甲醛固定后脫水包埋得到的組織切片。加入一抗二抗，經(jīng)DAB底物顯色，用普通的顯微鏡觀察信號(hào)分布和強(qiáng)度。專業(yè)一點(diǎn)，免疫組化包括免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)，即IHC和ICC。ICC與IHC的區(qū)別在于樣品的不同，ICC的樣品是細(xì)胞（提前制作的細(xì)胞爬片），并且常用熒光染色檢測(cè)，也可以用酶聯(lián)抗體顯色，最后分別用熒光顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡觀察和拍照。IF技術(shù)所用的樣品范圍廣，可以用石蠟切片、冰凍切片，也可以用細(xì)胞爬片。而IHC多用石蠟切片，因?yàn)槭炃衅鼙３滞暾慕M織型態(tài)和蛋白表達(dá)位置，樣本可大可小。冰凍切片由于不需要經(jīng)過固定、脫水和修復(fù)等過程，蛋白的結(jié)構(gòu)保持地更好一些，步驟也更簡(jiǎn)單快捷，是術(shù)中病理診斷的常用技術(shù)。用IF做ICC和冰凍切片的染色，過程類似。
IHC、ICC和IF的原理有相似之處，本質(zhì)上都是利用了抗原抗體的特異性結(jié)合。IHC和ICC中的“化學(xué)”，顧名思義，是通過化學(xué)反應(yīng)顯色。IF中的“熒光”是通過熒光基團(tuán)被相應(yīng)的激發(fā)光激發(fā)而發(fā)光，從而被檢測(cè)到。不同之處在于，IHC和ICC是通過在二抗上偶聯(lián)HRP（辣根過氧化物酶），以過氧化氫為底物，產(chǎn)生游離氧，后者使無色的供氫體DAB氧化為棕褐色沉淀定位于過氧化物酶所在部位。而IF則是在二抗上偶聯(lián)熒光基團(tuán)，在相應(yīng)波長(zhǎng)的激光激發(fā)下而發(fā)出熒光（是熒光染料的特性）。因此，前者用普通的光學(xué)顯微鏡即可觀察到，而后者需要用熒光顯微鏡?？梢愿鶕?jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜ミx擇不同的顯微鏡，如果只是簡(jiǎn)單的定位，要求可以低一些，如果需要做準(zhǔn)確一點(diǎn)的定位和定量，需要更高分辨率的顯微鏡。
? ? 我的課題做IHC和多標(biāo)（mIHC）較多，故而，我會(huì)對(duì)IHC的講解更加細(xì)致一些。
? ? 肝臟組織固定收其中的兩個(gè)中等大小的肝葉，用4%多聚甲醛的固定過夜（16~18h）。甲醛使組織中的蛋白交聯(lián)，將組織形態(tài)固定住，同時(shí)使組織更致密且硬度增大。1xPBS洗三遍之后進(jìn)行脫水，從75%EtOH開始，一般2~3h即可，如果當(dāng)天來不及脫水（全程約10h），便可以在75%乙醇中過夜，甚至放一周也沒問題。從75%-85%-95%-100%EtOH梯度脫水，是為了防止組織快速收縮，改變了組織形態(tài)，使得信號(hào)不容易被檢測(cè)到。由于最后要用石蠟包埋，且組織內(nèi)部和周邊的石蠟最好達(dá)到均質(zhì)的狀態(tài)，才會(huì)利于切出完整的組織切片，而且100%乙醇與石蠟不互溶，二甲苯是石蠟的溶劑，所以不能直接通過乙醇直接浸入石蠟，而需要用二甲苯替換出組織中的無水乙醇，最后浸入石蠟中過夜，讓石蠟充分進(jìn)入組織。切片時(shí)選擇5um的厚度，37℃展片和烘片。其實(shí)不必執(zhí)著于時(shí)間，展片的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是切片完全展開沒有褶皺，并且石蠟不能融化，注意貼片時(shí)的手法，一般來說沒有什么問題。烘片的目的是讓組織與玻片完整貼合固定，并且烘干表面和周圍的水，一般來說過夜后第二天收起來就可以了，四度保存。
? ? 下面說一下IHC染色的問題。
? ? 做過IHC的朋友都知道，這個(gè)實(shí)驗(yàn)很耗時(shí)間，一做就是兩天，其中大部分時(shí)間都是零零散散，最重要的工作莫過于等待。個(gè)人認(rèn)為做IHC的關(guān)鍵點(diǎn)在于：洗干凈和二抗的孵育時(shí)間。如果洗不干凈或者二抗孵育時(shí)間過長(zhǎng)，肯定會(huì)造成非特異性染色，也就是背景，導(dǎo)致染色質(zhì)量很差，甚至忙活幾天都不能拿到具有分析價(jià)值的結(jié)果。我們做肝臟切片，用5%NGS（normal goat serum）封閉時(shí)間可以長(zhǎng)一些（如果中間有事情），但最少一個(gè)小時(shí)。二抗的孵育時(shí)間是30min，AB complex（avidin+biotin）的孵育時(shí)間也是30min。由于二抗和avidin孵育時(shí)間長(zhǎng)的情況下，會(huì)有非特異性染色，具體的原理，在后面介紹avidin+biotin的時(shí)候再細(xì)講。我們實(shí)驗(yàn)室是固定DAB的顯色時(shí)間是5min，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度來調(diào)整一抗的濃度。當(dāng)然也可以摸DAB的顯色時(shí)間，但個(gè)人覺得不太好把控。因?yàn)榭贵w的適合濃度是一個(gè)較大的范圍，而DAB的顯色時(shí)間很短。
? ? 用單蒸水和1xTBST洗片子最好放在搖床上搖洗，會(huì)減少背景，親測(cè)管用。再有一點(diǎn)就是畫阻水圈，不要畫太粗太細(xì)，更不要畫地太靠近組織，否則滴加的極性試劑遇到油性阻水圈形成的液面會(huì)變高，導(dǎo)致組織邊緣接觸不到試劑而變干，從而有很高的背景。
? ? IHC整個(gè)過程除了洗，我們加的試劑有SP6000（vector）、5%NGS（goat）、Avidin、Biotin、一抗、二抗、A+B complex、DAB。下面說一下試劑的作用原理。SP6000是Vector公司出的試劑，用于封閉內(nèi)源性的過氧化氫酶。由于二抗后面偶聯(lián)的HRP就是一種過氧化氫酶，如果內(nèi)源性過氧化氫酶太多，會(huì)造成非特異性著色。5%NGS是為了封閉內(nèi)源蛋白，因?yàn)槎箤?duì)于一抗的識(shí)別是由于Fc片段，如果其他蛋白也有Fc片段同樣會(huì)被識(shí)別，從而造成非特異性著色。在這里應(yīng)該想到做western blot時(shí)用5%脫脂乳粉封閉，原因之一是為了將NC膜或PVDF膜上的未能結(jié)合蛋白的孔隙封閉住，防止二抗結(jié)合到孔內(nèi)造成背景色，原因之二就是封閉其他的可能會(huì)與一抗結(jié)和的雜蛋白。血清的來源只要與一抗的來源不一樣即可，goat和bovin都可以，因?yàn)橐豢箒碓闯Ｒ姷臒o非是mouse或rabbit，選擇一個(gè)通用的更便于實(shí)驗(yàn)。我們實(shí)驗(yàn)室做肝癌，肝臟細(xì)胞中有大量的內(nèi)源性生物素（Biotin），由于二抗之后需要avidin-biotin-HRP的信號(hào)放大過程，前面需要加入外源的avidin封閉內(nèi)源性的biotin（Avidin-Biotin高親和）。由于Biotin是羧化酶的輔因子，Biotin會(huì)結(jié)合到酶的特殊位點(diǎn)上幫助酶發(fā)揮催化作用，再加入Biotin去封閉酶上的biotin的結(jié)合位點(diǎn)，在孵育AB complex的過程中才不會(huì)導(dǎo)致過量的biotin結(jié)合到酶的位點(diǎn)上，造成非特異性信號(hào)。WB的二抗上面直接偶聯(lián)HRP，而IHC的二抗上面通過偶聯(lián)Biotin的亞基，利用biotin和avidin的高親和力來提高HRP的量，從而放大信號(hào)。二抗上面偶聯(lián)HRP的量很少，而一抗結(jié)合二抗的數(shù)量有限。一個(gè)二抗結(jié)合一個(gè)biotin，一個(gè)biotin連接一個(gè)avidin，而一個(gè)avidin可以有四個(gè)基團(tuán)連接biotin，于是達(dá)到了信號(hào)放大的目的。
? ? 明確實(shí)驗(yàn)原理不等于能做好實(shí)驗(yàn)，個(gè)人認(rèn)為實(shí)驗(yàn)習(xí)慣非常重要，不僅要心明眼亮，更要手穩(wěn)，才能重復(fù)出來高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
? ? 后面會(huì)出一篇多標(biāo)染色和一篇avidin-biotin的結(jié)合原理，敬請(qǐng)期待！
