各類組學(xué)研究中，一方面?zhèn)鹘y(tǒng)的組織塊測(cè)序能獲得細(xì)胞群體的總體平均特征而識(shí)別不了單個(gè)細(xì)胞的特征，其分辨率較低。如同撰稿人的照片一樣當(dāng)分辨率低的時(shí)候只能看清輪廓。另一方面，組織塊測(cè)序忽略了稀有細(xì)胞的作用。正如真理掌握在少數(shù)人手里一樣，那部分稀有細(xì)胞群往往起著重要功能。如果后續(xù)分離單細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，就能夠以更高的分辨率揭示細(xì)胞間的差異及其在微環(huán)境中的功能情況。單細(xì)胞測(cè)序由于上述獨(dú)特的分辨率高且能獲得稀有細(xì)胞信息的優(yōu)勢(shì)，其發(fā)表在頂級(jí)期刊上的文章居多。
1?繪制細(xì)胞圖譜鑒別異常細(xì)胞類型及起源
單細(xì)胞譜圖的構(gòu)建，獲取不同細(xì)胞的功能情況。對(duì)每個(gè)細(xì)胞表達(dá)情況進(jìn)行數(shù)據(jù)降維（t-SNE、UMAP分型），基于聚類分析結(jié)果對(duì)不同類群的細(xì)胞進(jìn)行注釋，尋找細(xì)胞群之間的差異。多數(shù)單細(xì)胞研究都是基于細(xì)胞圖譜發(fā)表描述性文章。
2?低成本發(fā)掘未知細(xì)胞種類
獲得新的細(xì)胞類型，屬于新科學(xué)發(fā)現(xiàn)，不僅有助于后續(xù)細(xì)胞功能研究，而且還能有助于臨床應(yīng)用。如循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells）的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于癌癥患者的臨床診斷治療有很大的幫助。
3?幾個(gè)月搞定需多年時(shí)間的發(fā)育研究
獲取細(xì)胞的分化過程中是由于哪些特定基因改變的結(jié)果，在發(fā)育生物學(xué)中至關(guān)重要。單細(xì)胞測(cè)序能快速高效地對(duì)特定細(xì)胞群進(jìn)行分化軌跡與譜系示蹤分析，從而鑒定細(xì)胞不同分化狀態(tài)下的潛在調(diào)節(jié)基因。
目前10x Genomics平臺(tái)操作便捷且性價(jià)比高，成為科研工作者競(jìng)相追逐使用的單細(xì)胞捕獲平臺(tái)?；谠撈脚_(tái)在各個(gè)領(lǐng)域的文章數(shù)目來看，其主要應(yīng)用的研究方向是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
特別是近年來10x Genomics平臺(tái)的文章發(fā)表與日俱增，足以說明單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)正在逐步成為科研工作者主流關(guān)注的熱點(diǎn)。
高分文章往往離不開嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，對(duì)于研究者來說生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需要遵守的一條亙古不變的準(zhǔn)則是：基于生物學(xué)問題選擇對(duì)應(yīng)的研究方法。單細(xì)胞測(cè)序研究亦是如此。目前單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組領(lǐng)域熱門的有兩種平臺(tái)技術(shù)：如果有目的細(xì)胞群作為候選研究對(duì)象，并且要獲取目的稀有細(xì)胞群的基因表達(dá)及轉(zhuǎn)錄本的可變剪切、基因融合等變異信息，這種需要mRNA測(cè)到全長(zhǎng)且覆蓋度高，可以選擇Smart seq2這種低通量單細(xì)胞方法進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；如果為了獲得細(xì)胞譜圖，盡可能的檢測(cè)更多的細(xì)胞類型，則選擇海量單細(xì)胞測(cè)序（10x Genomics）更加合適。
一旦確定好了單細(xì)胞的研究方法，后續(xù)就要考慮大部分研究者都比較頭疼的問題——組織解離的方法。組織能否成功解離單細(xì)胞也就決定了后續(xù)實(shí)驗(yàn)是否能順利進(jìn)行，一般組織經(jīng)過切割成碎片后，會(huì)使用特定的酶進(jìn)行解離，涉及酶濃度、酶解時(shí)間、溫度等信息，對(duì)此可以參考如下文獻(xiàn)中的表格：人和小鼠的部分組織類型。當(dāng)然，單管單細(xì)胞一般使用口吸管法、顯微切割等方法居多。
Tutorial: guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.?Nat Protoc.2018;13(12):2742-2757.IF:10.419?doi:10.1038/s41596-018-0073-y
單細(xì)胞研究思路
總結(jié)目前單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相關(guān)文章的內(nèi)容結(jié)構(gòu)，發(fā)文思路一般分五個(gè)主要部分：
Step1 數(shù)據(jù)質(zhì)控
根據(jù)數(shù)據(jù)質(zhì)控確定測(cè)序結(jié)果的可靠性。涉及到的參數(shù)有：比對(duì)率、Q20\Q30、平均每個(gè)細(xì)胞測(cè)得基因數(shù)等。
Ba, H., Wang, D., Wu, W. et al. Single-cell transcriptome provides novel insights into antler stem cells, a cell type capable of mammalian organ regeneration.?Funct Integr Genomics?(2019).?IF=3.89https://doi.org/10.1007/s10142-019-00659-2
Step2 細(xì)胞分群
對(duì)質(zhì)控后的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行單細(xì)胞表達(dá)定量分析，根據(jù)各細(xì)胞基因表達(dá)特征劃分細(xì)胞群
這個(gè)過程需要借助已發(fā)表文獻(xiàn)或數(shù)據(jù)庫查找出鑒定細(xì)胞類型的marker基因，并對(duì)不同的細(xì)胞類型進(jìn)行命名（注釋鑒定）。此過程即可獲得細(xì)胞譜圖結(jié)果。
The cellular and molecular landscape of hypothalamic patterning and differentiation from embryonic to late postnatal development.?Nat Commun.?2020;11(1):4360.?IF: 11.8780?doi:10.1038/s41467-020-18231-z
Step3 挑選目標(biāo)細(xì)胞亞群
該步驟一般需要根據(jù)課題前期成果，結(jié)合目前研究背景進(jìn)行挑選目的細(xì)胞亞群：
如step2中未注釋上的細(xì)胞群極有可能是新細(xì)胞或稀有細(xì)胞，后續(xù)可以深入研究。而這種發(fā)現(xiàn)一般是可遇不可求，對(duì)于經(jīng)典的單細(xì)胞數(shù)據(jù)挖掘有以下這幾種方式：
1 對(duì)于單樣本測(cè)序分析，一般依據(jù)各種類型細(xì)胞的特異表達(dá)基因確定其功能，尋找目標(biāo)細(xì)胞亞群（特定功能細(xì)胞）進(jìn)行后續(xù)研究。同時(shí)，也可以對(duì)一個(gè)較大的細(xì)胞群進(jìn)行細(xì)分以更加細(xì)致地研究細(xì)胞類型與功能。
The bone marrow microenvironment at single-cell resolution[J].?Nature,?2019: 1.?IF= 42.7doi:10.1038/s41586-019-1104-8
2 對(duì)于多個(gè)樣本測(cè)序分析。一方面，尋找相同細(xì)胞在不同樣本中（不同條件處理下）的表達(dá)變化，即目標(biāo)細(xì)胞類型在不同條件下的表達(dá)變化；另一方面，可以獲取不同條件下細(xì)胞類型組成占比的變化。進(jìn)而挖掘出疾病相關(guān)（或與研究方向相關(guān)）的細(xì)胞類型。
“Atheroprotective?roles?of?smooth?muscle?cell?phenotypic?modulation?and the TCF21?disease?gene as?revealed by?single-cell?analysis.”?Nat.Med.?2019 Jul 29.?IF=30.64?doi:10.1038/s41591-019-0512-5.
Step4 目標(biāo)亞群重點(diǎn)分析
基于上述鎖定的目標(biāo)細(xì)胞群的分析分為兩類：
1 對(duì)挑選出的目的細(xì)胞類型進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，或與其他類型細(xì)胞進(jìn)行差異比較得出功能異同點(diǎn)，解釋生物學(xué)現(xiàn)象。或者對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞通訊分析說明生物學(xué)問題。
Publisher Correction: Global characterization of T cells in non-small-cell lung cancer by single-cell sequencing.?Nat Med.?2018;24(10):1628.?IF=30.64?doi:10.1038/s41591-018-0167-7
2 分化軌跡與譜系示蹤，鑒定不同分化過程中的潛在調(diào)節(jié)基因，分析關(guān)鍵基因的表達(dá)情況。
The cellular and molecular landscape of hypothalamic patterning and differentiation from embryonic to late postnatal development.?Nat Commun.?2020;11(1):4360.?IF: 11.8780?doi:10.1038/s41467-020-18231-z
Step5 目標(biāo)細(xì)胞功能驗(yàn)證
對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行細(xì)致嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)驗(yàn)證是必不可少的：
1、marker基因表達(dá)的驗(yàn)證：RNA FISH、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)。
2、marker基因相關(guān)信號(hào)通路的驗(yàn)證
3、對(duì)新細(xì)胞群的功能驗(yàn)證：流式分選獲得特定細(xì)胞進(jìn)行SMART擴(kuò)增測(cè)序驗(yàn)證 ，或者ATAC-seq研究調(diào)控機(jī)制。
4、還原特定細(xì)胞對(duì)應(yīng)于組織的區(qū)域：利用gene marker的原位分子雜交。
Human Intestinal Organoids Maintain Self-Renewal Capacity and Cellular Diversity in Niche-Inspired Culture Condition.?Cell Stem Cell.?2018;23(6):787-793.e6.?IF: 20.860?doi:10.1016/j.stem.2018.11.016
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