什么是冷凍電鏡？
冷凍電子顯微技術(shù)（冷凍電鏡）始于玻璃化，在此過(guò)程中，蛋白質(zhì)溶液迅速冷卻，以至于水分子來(lái)不及結(jié)晶，從而形成對(duì)樣品結(jié)構(gòu)幾乎沒(méi)有破壞的非結(jié)晶固體（這一過(guò)程稱(chēng)為玻璃化）。隨后，將根據(jù)顆粒濃度、分布和取向來(lái)篩選樣品。接下來(lái)，將獲取一系列圖像，并通過(guò)計(jì)算提取二維類(lèi)。最后，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)重構(gòu)軟件的處理，生成準(zhǔn)確、詳細(xì)的亞細(xì)胞和分子級(jí)復(fù)雜生物結(jié)構(gòu) 3D 模型。這些模型可以顯示之前無(wú)法可視化的相互作用，這是很多科學(xué)成果的關(guān)鍵所在。
冷凍電鏡的歷史
冷凍電鏡歷史悠久，凝聚了很多研究團(tuán)體的努力，他們?yōu)槔鋬鲭婄R的演變和變革做出了同等重要的貢獻(xiàn)。經(jīng)過(guò) 40 多年的潛心研究，結(jié)構(gòu)生物學(xué)界取得了大量的技術(shù)進(jìn)步成果（探測(cè)器、自動(dòng)化、軟件等），最終使現(xiàn)代冷凍電鏡變成了可能。2017 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)頒給了三位用數(shù)十年時(shí)間致力于推動(dòng)冷凍電鏡發(fā)展的研究人員：
1975 年，Joachim Frank 開(kāi)始研究可以分析模糊 2D 圖像并將其重構(gòu)為銳利 3D 結(jié)構(gòu)的算法。?
1980 年代早期，Jacques Dubochet 成功將水玻璃化，從而使生物分子能夠在真空中保持它們的形狀。
1990 年，Richard Henderson 率先使用電子顯微鏡生成原子級(jí)分辨率的蛋白質(zhì)三維圖像。
大佬的圖片在這里，都是偶像級(jí)別的人物：
用我自己的一句話來(lái)概括：把諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了運(yùn)用物理學(xué)方法探測(cè)生物結(jié)構(gòu)的三位大佬
冷凍電鏡的崛起
冷凍電鏡相對(duì)于常規(guī)結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)的最大優(yōu)勢(shì)之一在于，它能夠分析大型、復(fù)雜和柔性的結(jié)構(gòu)。通常，這些結(jié)構(gòu)無(wú)法結(jié)晶以用于 X 射線晶體學(xué) (XRD) 分析，或體積過(guò)大且十分復(fù)雜，導(dǎo)致難以進(jìn)行核磁共振 (NMR) 光譜分析。這些結(jié)構(gòu)包括很多在生物學(xué)上很重要的蛋白質(zhì)，特別是具有膜蛋白質(zhì)等可變或柔性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在，一些成熟的結(jié)構(gòu)測(cè)定方法（XRD 和 NMR）經(jīng)常與冷凍電鏡密度圖相集成，以便得到復(fù)雜、動(dòng)態(tài)分子組裝的原子級(jí)分辨率模型。
自從 1997 年第一個(gè)基于冷凍電鏡重構(gòu)的模型存入 PDB（蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)）以來(lái)，存入的結(jié)構(gòu)數(shù)量呈現(xiàn)出指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。冷凍電鏡是 2016 年 EMDB 條目突破 1,000 的原因所在，所有條目數(shù)量的四分之一就是在這一年存入的。在這些最近存入的數(shù)據(jù)中，很多包括了之前被認(rèn)為無(wú)法進(jìn)行結(jié)構(gòu)測(cè)定的關(guān)鍵大分子組裝。
科學(xué)成果
在冷凍電鏡的幫助下，研究人員定義了世界上第一個(gè)共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變 (ATM) 基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。ATM 是 DNA 損傷反應(yīng)中的一個(gè)關(guān)鍵觸發(fā)蛋白質(zhì)，也是癌癥研究中的主要治療目標(biāo)。這一研究可以在抗癌新藥的開(kāi)發(fā)中證明自身無(wú)可估量的價(jià)值?！?a target="_blank">Science Advances》，2017 年 5 月 10 日。
研究人員已經(jīng)使用冷凍電鏡測(cè)定了 B 類(lèi) G 蛋白偶聯(lián)受體 (GPCR) 的三元復(fù)合體結(jié)構(gòu)，這是一種難以通過(guò)其他方法分析的重要膜蛋白質(zhì)復(fù)合體?！?a target="_blank">自然》，2017 年 6 月 1 日。
利用 Thermo Scientific??Krios 冷凍 TEM?和?SPA 工作流，研究人員得以更清晰地解析多種病毒的結(jié)構(gòu)，包括 HIV、寨卡、埃博拉和 C 型鼻病毒?！?a target="_blank">PNA》，2016 年 8 月 9 日。
單顆粒cryo-EM實(shí)驗(yàn)方法
流程圖大致如下：
