RAD-Seq(restriction site-associated DNA sequencing)最開始指的是2008年發(fā)表在PLOS ONE上“Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers"提出的方法，目前該文章的引用已經(jīng)達(dá)到1200+，現(xiàn)在指代的是一系列基于限制性內(nèi)切酶的測序技術(shù)。同樣在概念上被引申的還有GBS(genotyping-by-sequencing),只不過GBS的名字不能讓你直接把它和限制性內(nèi)切酶聯(lián)想起來.總之，如果現(xiàn)在公司給你推薦GBS或RAD-seq時，可能未必和你想的一樣，你需要仔細(xì)問下他們的建庫手段。畢竟手段不同，你的實(shí)驗(yàn)設(shè)計，操作和結(jié)果都會發(fā)生變化。這是RAD-seq相關(guān)方法的歷年引用情況
RAD-seq雖說方法很多，但是文庫構(gòu)建流程大致如下，不同方法在其中某些步驟存在差異
- 起始基因組DNA量：能否允許降解FNA
- 限制性內(nèi)切酶酶解：限制酶種類，數(shù)量
- 酶切位點(diǎn)結(jié)合接頭：接頭類型
- 酶解片段大小選擇：直接選擇，間接選擇
- 添加barcode混池：視v接頭而異
- 測序類型選擇：單端，雙端
兩者的差異在于，1）是現(xiàn)進(jìn)行酶切然后隨機(jī)破碎，最后僅選擇存在酶切位點(diǎn)片段測序；2）也是酶切，但是后續(xù)直接選擇合適大小的片段測序。
因此相對于1）測序的位點(diǎn)平均會少一點(diǎn)，也就會導(dǎo)致同一批樣本后者利用率低于前者。無參考基因組更推薦前者，而不是后者。
原始RAD-seqs
最先提出的RAD-seq技術(shù)流程，也就是RAD-seq的冠名技術(shù)，分為如下幾步：
- 基因組DNA用限制性內(nèi)切酶裂解， 然后連接到P1接頭。P1接頭里含有正向擴(kuò)增和Illumina測序引物位點(diǎn)，以及4~5 bp 的核酸barcode. barcode至少大于3 bp。
- 之后接頭連接的片段(adapter-ligated fragments)混池，隨機(jī)打斷
- DNA隨后連接到P2接頭，反向擴(kuò)增擴(kuò)展引物無法連接P2. P2是一種Y型接頭，包含P2反向擴(kuò)增引物位點(diǎn)的反向互補(bǔ)序列，使得不含P1接頭的片段無法擴(kuò)增。(Y型接頭的工作原理)
- 最后僅有同時含P1和P2接頭的片段能夠上機(jī)測序。
Genotyping-by-Sequencing
GBS比原始的RAD-seq步驟更加簡單
- 將不同樣本和含不同barcode接頭成對放在平板里
- 使用ApeKI限制酶進(jìn)行酶解
- 使用T4連接酶，將接頭連接到片段兩端因酶切產(chǎn)生的粘末端（stcky end）
- 將含不同barcode的樣本混池，隨后過片段長度篩選柱，過濾尚未反應(yīng)的接頭
- 加入PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增
這里沒有直接對片段進(jìn)行篩選，但是PCR擴(kuò)增時優(yōu)先擴(kuò)增小片段
ddRAD-seq
ddRAD-seq和GBS相似，兩者都不需要在加接頭后進(jìn)行隨機(jī)打碎，GBS通過PCR擴(kuò)增的方式過濾了大片段，而ddRAD-seq通過雙酶切的方式，然后篩選固定長度來選擇合適大小的片段
常見方法的比較
其實(shí)這些RAD-seq文庫制備方法可以簡單的分為兩類：
- 1）對單酶切位點(diǎn)鄰近片段測序，如最初的RAD-seq
- 2）對酶切位點(diǎn)兩翼片段測序，如Genoytping-by-Sequencing
下面是常見的物RAD-seq方法比較
| 方法 | 原始RAD | 2bRAD | GBS | ddRAD | ezRAD |
|---|---|---|---|---|---|
| 控制位點(diǎn)的方法 | 選擇限制酶 | 選擇限制酶 | 選擇限制酶 | 選擇限制酶和片段大小選擇閾值 | 選擇限制酶和片段大小選擇閾值 |
| 位點(diǎn)數(shù)/Mb | 30～500 | 50～1000 | 5～40 | 0.3～200 | 10～800 |
| 位點(diǎn)長度 | 300bp 或1kb contig | 33–36 bp | < 300 bp | < 300 bp | <300 bp |
| barcode費(fèi)用/樣本 | 低 | 低 | 低 | 低 | 高 |
| 添加barcode難度/樣本 | 中等 | 低 | 低 | 低 | 高 |
| 是否用到專利試劑盒 | 否 | 否 | 否 | 否 | 是 |
| 識別PCR重復(fù) | 使用雙端測序 | 不能 | 使用降解的barcode | 用降解的barcode | 不能 |
| 特殊的設(shè)備 | 超聲破碎儀 | 無 | 無 | Pippin Prep或普通的跑膠儀 | Pippin Prep或普通的跑膠儀 |
| 是否適用復(fù)雜和大基因組 | 好 | 差 | 中等 | 好 | 好 |
| 是否適用無參考基因組 | 好 | 差 | 中等 | 中等 | 中等 |
參考文獻(xiàn)
- RAD-seq: Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers
- GBS: A Robust, Simple Genotyping-by-Sequencing (GBS) Approach for High Diversity Species
- ddRAD-seq: Double Digest RADseq: An Inexpensive Method for De Novo SNP Discovery and Genotyping in Model and Non-Model Species
- 2011 NATURE REVIEWS | GENETICS：Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation
- 2016 NATURE REVIEWS | GENETICS：Harnessing the power of RADseq for ecological and evolutionary genomics
