Comprehensive analysis of the immunological implication and prognostic value of CXCR4 in non-small cell lung cancer
CXCR4在非小細(xì)胞肺癌中的免疫學(xué)意義和預(yù)后價(jià)值的綜合分析
發(fā)表期刊：CANCER IMMUNOL IMMUN
發(fā)表日期：2022 Oct 29
影響因子：6.630
DOI:? 10.1007/s00262-022-03298-y
一、研究背景
????????肺癌的死亡率最高，發(fā)病率在各種癌癥中排名第二，約占癌癥相關(guān)死亡總數(shù)的18%。它是一種高度惡性的腫瘤。根據(jù)組織病理學(xué)類(lèi)型，約85%的肺癌被歸為非小細(xì)胞肺癌（NSCLC），其中肺腺癌（LUAD）和肺鱗癌（LUSC）是最常見(jiàn)的亞型。
????????目前有48種趨化因子，屬于四個(gè)亞家族；它們與七種跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）相互作用，在體內(nèi)不同條件下影響免疫細(xì)胞的運(yùn)輸。近年來(lái)，許多研究表明，趨化因子/趨化因子受體環(huán)路以自分泌和旁分泌形式相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生存和生長(zhǎng)，加速腫瘤新血管生成。
二、材料與方法
1、數(shù)據(jù)來(lái)源
1） 實(shí)驗(yàn)部分涉及中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院國(guó)家癌癥中心/癌癥醫(yī)院（NCC/CAMS，中國(guó)北京）的NSCLC患者的回顧性研究，包括242名LUAD患者和188名LUSC患者（隊(duì)列1）
2） 13名LUAD患者和33名LUSC患者（隊(duì)列2）
3） CXCR4 mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)和突變注釋數(shù)據(jù)從癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)下載
4） LUAD樣本數(shù)據(jù)集（535個(gè)癌癥組織和59個(gè)正常組織）和LUSC樣本數(shù)據(jù)表達(dá)譜（502個(gè)癌癥組織和49個(gè)正常組織）均從TCGA獲得
5） 從癌癥細(xì)胞系百科全書(shū)（CCLE）數(shù)據(jù)庫(kù)中提取了188個(gè)肺癌細(xì)胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)
2、分析流程
1） NSCLC中的腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞景觀(guān)及其與CXCR4的相關(guān)性：CIBERSORT、TIMER
2） 評(píng)估CXCR4表達(dá)對(duì)預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)的作用：從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了經(jīng)典免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)數(shù)據(jù)，分析了CXCR4表達(dá)與這些標(biāo)志物之間的差異和關(guān)聯(lián)性；加入被廣泛認(rèn)可的免疫反應(yīng)標(biāo)志物，腫瘤突變負(fù)擔(dān)（TMB）、免疫分?jǐn)?shù)（IPS）、新抗原和腫瘤免疫功能紊亂和排斥（TIDE）分?jǐn)?shù)，以進(jìn)一步評(píng)估CXCR4潛在的免疫治療反應(yīng)預(yù)測(cè)性能
3） 基因組富集分析：GSEA
4） 免疫調(diào)節(jié)劑的確定及其與CXCR4的關(guān)系從TISIDB中確定了與CXCR4顯著相關(guān)的免疫刺激劑和免疫抑制劑，將這些免疫調(diào)節(jié)劑輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，以生成一個(gè)蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，并探討它們?cè)贜SCLC中的意義；進(jìn)行了GO注釋和KEGG途徑富集分析
5） CXCR4相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑簽名和nomogram的構(gòu)建：識(shí)別出與LUAD和LUSC表現(xiàn)出明顯相關(guān)性的免疫刺激因子和免疫抑制劑，并采用Cox模型中的Akaike信息準(zhǔn)則對(duì)變量進(jìn)行依次篩選；對(duì)年齡和TNM分期進(jìn)行了單變量和多變量Cox回歸分析，以確定NSCLC患者的獨(dú)立預(yù)后因素；構(gòu)建一個(gè)nomogram，為每個(gè)NSCLC患者的疾病進(jìn)展提供一個(gè)預(yù)測(cè)模型
6） 免疫組化（IHC）染色和CXCR4表達(dá)的評(píng)估、RNA制備和RT-PCR
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01 - CXCR4與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性
????????利用CIBERSORT程序計(jì)算TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中LUAD和LUSC患者的基因表達(dá)譜得到22種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)率。LUAD和LUSC患者組織中的幼稚B細(xì)胞、漿細(xì)胞、T濾泡輔助細(xì)胞、T調(diào)節(jié)細(xì)胞、γδT細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞、靜止樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)水平明顯高于正常組織。腫瘤組織中靜止的CD4記憶T細(xì)胞、活化的CD4記憶T細(xì)胞、單核細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、靜止的肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)水平都明顯高于正常組織。記憶B細(xì)胞在LUAD組織中尤其明顯富集，而M0巨噬細(xì)胞和活化的DC在LUSC患者中明顯富集。靜止的自然殺傷（NK）細(xì)胞的浸潤(rùn)水平在LUAD和LUSC中是對(duì)比鮮明的（圖1A，B）。22種免疫細(xì)胞在LUAD和LUSC腫瘤和正常組織中的不同浸潤(rùn)水平以熱圖的形式顯示出來(lái)（圖1C，D）。此外，相關(guān)熱圖顯示，22種免疫細(xì)胞在LUAD和LUSC腫瘤中表現(xiàn)出弱到中等程度的相關(guān)性（圖1E，F(xiàn)）。
????????為了探索CXCR4表達(dá)協(xié)調(diào)LUAD和LUSC變化的潛在機(jī)制，確定了與CXCR4相關(guān)的突變基因。根據(jù)CXCR4表達(dá)的中位數(shù)將LUAD患者（補(bǔ)充圖2A，C）和LUSC患者（補(bǔ)充圖2B，D）分為高表達(dá)組和低表達(dá)組后，構(gòu)建了一個(gè)熱圖來(lái)確定與CXCR4表達(dá)相關(guān)的突變基因的突變頻率。隨后，發(fā)現(xiàn)DNAH8、PAPPA2、SPHKAP、XIRP2和ZNF804B（補(bǔ)充圖2E）的突變頻率在LUAD隊(duì)列的CXCR4高表達(dá)組和低表達(dá)組中存在明顯差異。同樣，CSMD2、PCDH15、RELN、SI和ZNF804A的突變頻率在LUSC隊(duì)列的CXCR4高表達(dá)和低表達(dá)組中也有明顯不同（補(bǔ)充圖2F）。
????????為了闡明CXCR4調(diào)節(jié)不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的內(nèi)在機(jī)制，作者首先調(diào)查了主要免疫細(xì)胞與CXCR4表達(dá)之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)在LUAD中，CXCR4與腫瘤純度呈中度負(fù)相關(guān)，而與B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和DC細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)呈中度正相關(guān)（補(bǔ)充圖3A）。在LUSC中，CXCR4的表達(dá)與主要免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性與LUAD中觀(guān)察到的相似，但更為顯著，特別是CXCR4與DC細(xì)胞之間的相關(guān)系數(shù)為0.624（補(bǔ)充圖3B）。接下來(lái)，分析了CXCR4中的體細(xì)胞CNAs對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。在LUAD中，CXCR4中的CNAs，包括臂級(jí)缺失和臂級(jí)增益，顯著影響B(tài)細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和DCs的浸潤(rùn)水平（補(bǔ)充圖3c）。在LUSC中，臂級(jí)增益和高擴(kuò)增顯著影響B(tài)細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和DCs的浸潤(rùn)水平（補(bǔ)充圖3D）。此外，還評(píng)估了LUAD和LUSC中CXCR4表達(dá)和22種免疫細(xì)胞之間的相關(guān)性。
02 - CXCR4在預(yù)測(cè)NSCLC患者免疫治療反應(yīng)中的潛在價(jià)值
????????為了探索CXCR4預(yù)測(cè)NSCLC患者免疫治療反應(yīng)的可能性，將PD1（PDCD1）、PDL1（CD274）、CTLA4、LAG3、GAL9（LGALS9）、TIM-3（HAVCR2）、TIGIT和PD-1LG2（PDCD1LG2）作為免疫檢查點(diǎn)相關(guān)候選基因，評(píng)估其與CXCR4的關(guān)系。結(jié)果顯示，CXCR4與LUAD中這些經(jīng)典的免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)明顯正相關(guān)，PD1、CTLA4、TIM3、TIGIT和PD-1LG2的相關(guān)系數(shù)均大于0.5。此外，上述免疫檢查點(diǎn)在CXCR4高表達(dá)組明顯上調(diào)。在LUSC中，CXCR4和免疫檢查點(diǎn)之間的差異和相關(guān)關(guān)系呈現(xiàn)出與LUAD相同的趨勢(shì)。
????????近年來(lái)新開(kāi)發(fā)的、被廣泛認(rèn)可的免疫反應(yīng)標(biāo)志物，包括TMB、IPS、neoantigen、TIDE評(píng)分、T細(xì)胞功能障礙評(píng)分和T細(xì)胞排斥評(píng)分也被用于綜合評(píng)價(jià)。在LUAD中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)高低CXCR4表達(dá)組的TMB、IPS和neoantigen水平有明顯差異，但CXCR4高表達(dá)組的TIDE評(píng)分明顯較低，T細(xì)胞功能障礙評(píng)分較高，T細(xì)胞排除評(píng)分較低，說(shuō)明CXCR4高表達(dá)組可能對(duì)免疫治療更敏感（補(bǔ)充圖7A）。在LUSC中，CXCR4高表達(dá)組的TMB、IPS和T細(xì)胞功能障礙評(píng)分明顯增加，而TIDE評(píng)分和T細(xì)胞排異評(píng)分明顯下降，也顯示了CXCR4在預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)方面的潛力（補(bǔ)充圖7B）。
????????接下來(lái)，對(duì)患者（隊(duì)列2）進(jìn)行RT-PCR分析，以驗(yàn)證CXCR4表達(dá)與免疫治療反應(yīng)之間的相關(guān)性。在LUAD患者中，CXCR4的高表達(dá)與更好的免疫治療反應(yīng)基本一致。四名PR的患者中，有三人的CXCR4表達(dá)高于SD的患者（圖2A，B）。百分比直方圖還顯示，在LUAD中，CXCR4高表達(dá)組的反應(yīng)率高于低表達(dá)組，但由于樣本量的限制，沒(méi)有得到明顯的P值（圖2C）。在LUSC患者中，PR和CR患者顯示出CXCR4的高表達(dá)（圖2E，F(xiàn)）。百分比直方圖顯示，在LUSC中，CXCR4高表達(dá)組的反應(yīng)率高于低表達(dá)組（圖2G）。ROC曲線(xiàn)顯示，CXCR4表達(dá)在LUAD免疫治療反應(yīng)隊(duì)列中的AUC值為0.7778，在LUSC免疫治療反應(yīng)隊(duì)列中的AUC值為0.7231，表明CXCR4表達(dá)水平具有預(yù)測(cè)免疫療效的良好潛力（圖2D，H）。此外，對(duì)隊(duì)列2樣本進(jìn)行IHC染色，以探索CXCR4表達(dá)與免疫治療反應(yīng)的相關(guān)性。在最后的26個(gè)IHC染色樣本中，分別在LUAD、LUSC和總體三組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CXCR4高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的免疫治療反應(yīng)沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（補(bǔ)充圖8A-C）。然而，在26名NSCLC患者中，38%的樣本在RNA和蛋白水平上有一致的CXCR4表達(dá)，這需要通過(guò)擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證（補(bǔ)充圖8D）。
03 - CXCR4相關(guān)的生物過(guò)程和途徑
????????通過(guò)GSEA確定與LUAD和LUSC中CXCR4上調(diào)相關(guān)的信號(hào)通路。MYC靶點(diǎn)、異體移植排斥反應(yīng)、DNA修復(fù)和炎癥反應(yīng)是LUAD中富集的前四個(gè)通路（補(bǔ)充圖10A）。Notch信號(hào)、TGF-beta信號(hào)、頂端連接和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是LUSC富集的前四個(gè)途徑（補(bǔ)充圖10B）。CCLE數(shù)據(jù)庫(kù)中118個(gè)肺癌細(xì)胞系的RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，糖胺聚糖降解、長(zhǎng)期抑制、磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng)和半乳糖代謝是肺癌細(xì)胞中最豐富的信號(hào)通路（補(bǔ)充圖10C-F）。
04 - CXCR4在NSCLC中表達(dá)的預(yù)后潛力
????????為了闡明CXCR4表達(dá)在LUAD和LUSC中的預(yù)后價(jià)值，對(duì)NCC隊(duì)列的獨(dú)立樣本進(jìn)行了IHC染色和生存分析，發(fā)現(xiàn)CXCR4的高表達(dá)與LUAD（圖3A）以及LUSC患者（圖3B）的預(yù)后不良明顯相關(guān)。用CXCR4抗體對(duì)LUAD和LUSC腫瘤組織進(jìn)行IHC染色，分別見(jiàn)圖3C和D。
????????進(jìn)一步，LUAD患者的單變量分析顯示，OS與年齡、腫瘤長(zhǎng)度、分化程度、T期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和CXCR4表達(dá)顯著相關(guān)。多變量分析顯示，年齡、腫瘤長(zhǎng)度、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和CXCR4表達(dá)是LUAD的獨(dú)立預(yù)后因素。在LUSC患者中，OS與腫瘤長(zhǎng)度、分化程度、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，T分化程度、T分期和TNM分期被確定為L(zhǎng)USC的獨(dú)立預(yù)后因素。
05 - 構(gòu)建基于CXCR4相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑的預(yù)后特征
????????為了進(jìn)一步闡明CXCR4的免疫特性，作者鑒定了19種免疫刺激因子和11個(gè)免疫抑制劑與LUAD以及LUSC中的CXCR4顯著相關(guān)（圖4A, B）。隨后，在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建了一個(gè)包含30個(gè)明顯相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)劑的PPI網(wǎng)絡(luò)，包含30個(gè)節(jié)點(diǎn)和262條邊（圖4C）。GO富集分析顯示，這30種免疫調(diào)節(jié)劑所涉及的生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）涵蓋了淋巴細(xì)胞活化、白細(xì)胞細(xì)胞間粘附、質(zhì)膜外側(cè)、腫瘤壞死因子受體結(jié)合等調(diào)節(jié)。KEGG分析顯示了免疫調(diào)節(jié)劑參與的頂級(jí)信號(hào)途徑，包括腸道免疫網(wǎng)絡(luò)的IgA產(chǎn)生、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體的相互作用和細(xì)胞粘附分子（圖4D）。
????????為了探索CXCR4的預(yù)后價(jià)值，在LUAD和LUSC中構(gòu)建了基于CXCR4相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑的預(yù)后特征。在LUAD中，對(duì)確定的免疫調(diào)節(jié)因子進(jìn)行了單變量和多變量的Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)HAVCR2、TGFBR1、CD40LG、CD70、CD80、KLRK1、MICB和TNFRSF17與LUAD患者的OS顯著相關(guān)。隨后，調(diào)整了截止值，構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后特征。根據(jù)最低標(biāo)準(zhǔn)和每種免疫調(diào)節(jié)劑的風(fēng)險(xiǎn)得分，產(chǎn)生了一個(gè)包含12種免疫調(diào)節(jié)劑（HAVCR2、TGFBR1、CD40、CD40LG、CD70、CD80、CXCR4、ENTPD1、KLRK1、MICB、TNFRSF14和TNFRSF17）的簽名（圖5A）。LUAD風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算如下：
????????風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=（0.5448 * HAVCR）+（2.0341 * TGFBR1）+（0.7648 * CD40）+（0.3699 * CD40LG）+（2.9431 * CD70）+（0.6282 * CD80）+（0.6749 * CXCR4）+（0.7319 * ENTPD1）+（0.6553 * KLRK1）+（3.0730 * MICB）+（0.5057 * TNFRSF14）+（0.7327 * TNFRSF17表）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中值將患者分為高危組和低危組。生存分析顯示，高危組的OS明顯短于低危組（圖5C）。高危組和低危組的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和基于TNM分期的曲線(xiàn)下面積（AUC）分別為0.786和0.683，結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和TNM分期計(jì)算的AUC為0.816，表明該特征的預(yù)測(cè)性能良好（圖5E）。同樣，在LUSC中，根據(jù)CXCR4相關(guān)的免疫刺激物和免疫抑制劑構(gòu)建了16種免疫調(diào)節(jié)物（ADORA2A、BTLA、CTLA4、IDO1、TGFBR1、C10orf54、CD70、HHLA2、ICOSLG、IL6、IL6R、KLRC1、KLRK1、PVR、TNFRSF13C和TNFRSF18）的預(yù)后簽名（圖5B）。高風(fēng)險(xiǎn)分值與LUSC患者的不良預(yù)后明顯相關(guān)（圖5D）。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的ROC-AUC為0.809，通過(guò)結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和TNM分期計(jì)算的AUC為0.817（圖5F）。
?????????圖6A和B通過(guò)點(diǎn)狀分布圖和熱圖顯示每個(gè)LUAD和LUSC患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、OS和生存狀態(tài)。單變量Cox回歸模型顯示，TNM病理分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與LUAD和LUSC的OS顯著相關(guān)，多變量Cox回歸分析證實(shí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是LUAD的獨(dú)立預(yù)后因素（圖6C，D）。最后，根據(jù)LUAD和LUSC患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分構(gòu)建了一個(gè)預(yù)后nomogram，它可以通過(guò)不同的變量計(jì)算出3年和5年的生存概率。
四、結(jié)論
????????綜上所述，本研究初步顯示了免疫TME在NSCLC患者中的重要性，并確定了CXCR4與NSCLC免疫細(xì)胞浸潤(rùn)之間的相關(guān)性。作者在兩個(gè)NSCLC獨(dú)立隊(duì)列中證明了CXCR4在預(yù)測(cè)免疫治療反應(yīng)方面強(qiáng)大而可靠的預(yù)后價(jià)值和性能。更重要的是，所構(gòu)建的CXCR4相關(guān)免疫調(diào)節(jié)劑的預(yù)后特征被證明能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)LUAD和LUSC患者的生存狀態(tài)，并應(yīng)在臨床中實(shí)施。
