感受態(tài)細(xì)胞（competent cell）是指用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，吸收周圍環(huán)境中的DNA分子，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)。主要原理就是通過處理使細(xì)胞的通透性變大，直觀的說，使得細(xì)胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞，便于外源基因或載體進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。

其中大腸桿菌作為最早用于原核表達(dá)的菌株，其使用最為廣泛，后續(xù)衍生也相當(dāng)全面。其原理主要是，在進(jìn)行重組質(zhì)粒構(gòu)建的過程中，將目的基因片段連入載體構(gòu)建成含有目的基因片段的重組質(zhì)粒并獲得相應(yīng)菌株。并通過感受態(tài)細(xì)胞與野生菌株比較確認(rèn)是否得到所需基因片段。

由此在重組質(zhì)粒構(gòu)建中，感受態(tài)細(xì)胞是不可或缺的。接下來就以耀海生物常用的大腸桿菌為例學(xué)習(xí)其中涉及到的知識(shí)。

BL21

BL21是最常用于原核表達(dá)的菌株之一，其后續(xù)衍生包括BL21(DE3)、Rosetta、OrigamiB(DE3) 等一系列原核表達(dá)菌株。

BL21主要適用于非毒性蛋白的表達(dá)，因?yàn)槠洳缓琓7 RNA聚合酶，所以不適用于T7啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的蛋白表達(dá)(如：pET系列)。因?yàn)槠渚哂写竽c桿菌聚合酶，故可適用于tac或trc等使用大腸桿菌RNA聚合酶的原核系統(tǒng)的表達(dá)（如：pGEX，pMAL質(zhì)粒）

操作方法：

1. BL21感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待感受態(tài)細(xì)胞融化，加入目的DNA（質(zhì)粒或連接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置30分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

星耀小TIP：

1. 感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4. 誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2 mM均可）

5. 為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。

BL21（DE3）

BL21(DE3)菌株用于高效表達(dá)克隆于含有噬菌體T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體(如pET系列)的基因。λ噬菌體DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶，該基因整合于BL21的染色體上，所以稱為BL21(DE3)。可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。

操作方法：

1.快速轉(zhuǎn)化操作方法（10min）

(1). 提前10分鐘將用到的篩選培養(yǎng)基平板拿到37℃預(yù)熱。

(2). F-BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手撥打EP管底輕輕混勻，冰中靜置5分鐘。

(3). 用200 μl槍將感受態(tài)細(xì)胞-DNA混合物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基上，涂均勻，表面無水漬。

(4). 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

2.快速熱激轉(zhuǎn)化操作方法（25min,可提高轉(zhuǎn)化效率）

(1). F-BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手撥打EP管底輕輕混勻,，冰中靜置5分鐘。

(2). 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘（晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率）。加入700 μl不含抗生素的LB，37℃，200 rpm 復(fù)蘇10分鐘，涂板（均勻，表面無水漬）。

(3). 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

星耀小TIP

F-BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，無需42℃熱激，37℃孵育步驟，只需冰浴，10min內(nèi)完成轉(zhuǎn)化、涂板操作即可。

BL21（AI）

BL21(AI)來源于BL21菌株，為L(zhǎng)on蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，這兩種酶的缺失有效防止異源蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的降解。在培養(yǎng)基中添加L-阿拉伯糖可誘導(dǎo)araBAD啟動(dòng)子下游T7RNA聚合酶的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)目的蛋白的表達(dá)。在培養(yǎng)基中添加葡萄糖可抑制araBAD啟動(dòng)子下游T7RNA聚合酶的表達(dá)進(jìn)而抑制目的蛋白的表達(dá)。BL21(AI)感受態(tài)細(xì)胞適用于任何以T7啟動(dòng)子為基礎(chǔ)的表達(dá)載體，能夠進(jìn)行高水平的重組蛋白表達(dá)。因?yàn)榫昴軌驅(qū)w內(nèi)的T7 RNA聚合酶水平進(jìn)行高效調(diào)節(jié)，BL21(AI) 感受態(tài)細(xì)胞能夠表達(dá)對(duì)其他BL21細(xì)胞有毒性或抑制生長(zhǎng)的蛋白。普通重組蛋白在BL21(AI) 菌株中獲得產(chǎn)量和其他BL21菌株產(chǎn)量相當(dāng)；對(duì)大部分毒性蛋白，在BL21(AI) 菌株中獲得的產(chǎn)量高于BL21(DE3)pLysS菌株或BL21(DE3)菌株。

操作方法：

1. BL21(AI)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基（2YT或LB），混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。4. 5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含抗生素的2YT 或LB培養(yǎng)基上。5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

BL21(DE3)pLysS

BL21(DE3)pLysS菌株攜帶pLysS質(zhì)粒，具有氯霉素抗性。pLysS含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌，能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)，適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白。

操作方法：

1.BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含34 μg/ml氯霉素及所選質(zhì)粒篩選抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

BL21 Star(DE3)

BL21 Star(DE3)菌株源于BL21(DE3)菌株，含有rne131突變（RNaseE基因），RNaseE基因的突變降低了內(nèi)源RNase的積累，增強(qiáng)菌株細(xì)胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性，從而提高異源蛋白的表達(dá)水平。主要適用于T7啟動(dòng)子表達(dá)載體(如pET系列)的高水平蛋白表達(dá)，同時(shí)含有大腸桿菌RNA聚合酶，也可用于非T7啟動(dòng)子表達(dá)載體（pGEX，pMAL等）的蛋白表達(dá)。由于BL21 Star(DE3)菌株的異源基因基礎(chǔ)表達(dá)水平較高，所以不適合毒性蛋白的表達(dá)。

操作方法：

1.BL21 Star(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基(2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

星耀小TIP：

1.大腸桿菌DH5α一般做克隆或保存質(zhì)粒用，BL21用來做原核表達(dá)用。由于表達(dá)產(chǎn)量以及表達(dá)產(chǎn)物活性等各方面的原因，一般不使用DH5α作為表達(dá)菌。

2.Pet載體是大腸桿菌蛋白表達(dá)的首選載體，主要原因是目標(biāo)基因嚴(yán)格受T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄及翻譯信號(hào)控制，在宿主菌中無T7 RNA聚合酶時(shí)基因處于關(guān)閉不表達(dá)的狀態(tài)。因此用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因可以避免目的基因表達(dá)蛋白對(duì)宿主菌造成毒性而引起質(zhì)粒不穩(wěn)定。

BL21 Star(DE3)pLysS

BL21 Star(DE3)pLysS菌株來源于BL21(DE3)，含有rne131突變（RNaseE基因），RNaseE基因的突變降低了內(nèi)源RNase的積累，增強(qiáng)菌株細(xì)胞內(nèi)mRNA的穩(wěn)定性，從而提高異源蛋白的表達(dá)水平。主要適用于T7啟動(dòng)子表達(dá)載體(如pET系列)的高水平蛋白表達(dá)，同時(shí)含有大腸桿菌RNA聚合酶，也可用于非T7啟動(dòng)子表達(dá)載體（pGEX，pMAL等）的蛋白表達(dá)。由于BL21 Star(DE3)菌株的異源基因基礎(chǔ)表達(dá)水平較低，所以適合毒性蛋白的表達(dá)。BL21 Star(DE3)pLysS菌株攜帶pLysS質(zhì)粒，具有氯霉素抗性。pLysS含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌，還可與T7 RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)。pLysS質(zhì)粒含有p15A復(fù)制起始子，可以和含有 pUC或pBR322等復(fù)制起始子的質(zhì)粒兼容。

操作方法：

1. BL21 Star(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的質(zhì)粒并用手撥打EP管底輕輕混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基(2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

BL21-CodonPlus(de3)-RIPL

BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL菌株來源于Stratagene公司的BL21-Gold菌株，缺少Lon蛋白酶和OmpT蛋白酶，從而減少對(duì)重組蛋白的降解，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的4種稀有密碼子 (AGA, AUA, CCC, CUA)對(duì)應(yīng)的tRNA (argU, ileY, proL, leuW)，提高外源基因，尤其是富含AT-或 GC-的真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū) (DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)，可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列、pGEX、pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)，同時(shí)具有四環(huán)素，氯霉素，鏈霉素，壯觀霉素抗性。

操作方法：

1.BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基 (2YT或LB)，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT 或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。

Rosetta(DE3)

基因型：F-ompT?hsdSB(rB-mB-)?gal dcm(DE3) pRARE(argU, argW, ilex, glyT, leuW, proL) (CamR)

Rosetta 2(DE3)

基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3) pRARE2 (CamR)

Rosetta-gami 2(DE3)

基因型：D(ara-leu)7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL (DE3) F’[lac+ lacIq pro] gor522::Tn10 trxB pRARE2(CamR, StrR, TetR)

Rosetta-gami B(DE3)

基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm lacY1ahpC(DE3)gor522::Tn10trxBpRARE(CamR, KanR, TetR)

共有特征：

pRARE/pRARE2：賦予其Rosetta菌株的優(yōu)點(diǎn)——補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的6/7種稀有密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和[CGG])對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平?！臼褂脮r(shí)需添加34 μg/ml氯霉素防止質(zhì)粒丟失】

DE3：整合了λ噬菌體DE3區(qū) (DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)，同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶。

可用于pET系列，pGEX，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。

單獨(dú)特征：

Rosetta 2(DE3)：Lon蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株，這兩種酶的缺失有效防止異源蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的降解。

Rosetta-gami 2(DE3)：gor522::Tn10 trxB?賦予其Origami2菌株的優(yōu)點(diǎn)——突變的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它們是還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，其突變有利于高效形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性；同時(shí)該菌株不具有卡那霉素抗性，可用于具有卡那霉素抗性質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。

Rosetta-gami B(DE3)：除了gor522::Tn10 trxB以外，還具有lacY1基因?(半乳糖苷透性酶基因)突變賦予其Tuner菌株的優(yōu)點(diǎn)——IPTG以均一速度進(jìn)入體系中大腸桿菌的每個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生更加嚴(yán)格、均一的濃度依賴。

2.使用說明：

1．取100 μl感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中融化。

2．待感受態(tài)細(xì)胞融化后，向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的DNA（根據(jù)實(shí)際情況加入適量的DNA，通常100 μl感受態(tài)細(xì)胞能夠被1 ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和），用移液器輕輕吹打混勻，冰浴30min。

3．42℃熱擊45sec，然后快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中，冰上靜置2-3min，該過程不要搖動(dòng)離心管。

4．每個(gè)離心管中加入450 μl無菌的SOC或LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37℃搖床， 150 rpm振蕩培養(yǎng)45～60min使菌體復(fù)蘇。

5．根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，取適量已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞，加到含相應(yīng)抗生素的SOC或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無菌的涂布棒將細(xì)胞均勻涂開，將平板置于37℃直至液體被吸收，倒置培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)12~16h。

3.注意事項(xiàng)：

1．剛化凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率最高，避免反復(fù)化凍。

2．整個(gè)動(dòng)作要輕柔。

3．質(zhì)粒質(zhì)量和濃度等的差異會(huì)使轉(zhuǎn)化效率有所下降。

OrigamiB(DE3)

感受態(tài)細(xì)胞是采用大腸桿菌OrigamiB(DE3)菌株經(jīng)特殊工藝處理得到的感受態(tài)細(xì)胞，可用于DNA的化學(xué)轉(zhuǎn)化。使用pUC19質(zhì)粒檢測(cè)，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)107?cfu/μg，-70℃保存幾個(gè)月轉(zhuǎn)化效率不發(fā)生改變。每支感受態(tài)可以酌情分裝使用，降低了實(shí)驗(yàn)的成本。質(zhì)量穩(wěn)定，使用方便，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉。

基因型：?F-ompThsdSB(rB- mB-) galdcmlacY1ahpC(DE3)gor522::Tn10trxB(KanR,TetR)

抗生素耐藥性：細(xì)胞具有卡那霉素和四環(huán)素抗性。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.?適宜Amp抗性質(zhì)粒。

2. OrigamiB（DE3）菌株包含突變的硫氧還蛋白還原酶thioredoxin reductase(trxB)和谷胱甘肽還原酶glutathione reductase(gor)基因，表達(dá)主要還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶。有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性。

耀海分享

以上就是大腸桿菌感受態(tài)及其衍生菌株的感受態(tài)細(xì)胞的特性及其使用方式，由此可知作為最早被使用的原核的菌體，大腸桿菌感的應(yīng)用之廣泛和操作之成熟。通過以上的學(xué)習(xí)對(duì)于大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞原理，特性及使用有一定的了解。下面就以耀海生物的某一項(xiàng)目具體了解。

項(xiàng)目目的旨在將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入三種大腸桿菌表達(dá)宿主 BL21(DE3)、BL21STAR(DE3)、BL21-AI，經(jīng)抗生素抗性篩選陽性克隆，獲得重組表達(dá)菌株;通過搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 檢測(cè)分析，確認(rèn)目的蛋白表達(dá)及其表達(dá)水平，篩選優(yōu)勢(shì)菌株。

小編在此分享一下耀海生物生產(chǎn)車間內(nèi)的大致的工藝生產(chǎn)流程圖，以供參考：