? ? ? ?本次精讀的文獻(xiàn)是今年發(fā)表1月26日在線發(fā)表在《Autophagy》上的一篇文章，通訊作者是武漢大學(xué)的孫蒙祥教授，他一直致力于被子植物生殖發(fā)育生物學(xué)和生殖細(xì)胞工程的研究。該研究證明了自噬途徑參與了煙草花粉正常萌發(fā)的過(guò)程。

? ? ? 在先前鑒定煙草有關(guān)自噬基因的過(guò)程中，作者發(fā)現(xiàn)在花粉萌發(fā)的過(guò)程中與自噬相關(guān)的ATGs的表達(dá)量大大增加且在成熟的花粉當(dāng)中達(dá)到最大，暗示著自噬的過(guò)程可能參與了植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育。于是作者就想以煙草為模型探究是不是這樣。

? ? ? 幸運(yùn)的是，作者通過(guò)多種手段，發(fā)現(xiàn)在花粉的萌發(fā)過(guò)程中，自噬的活性就大大增強(qiáng)。利用透射電子顯微鏡在萌發(fā)后30min觀察，便發(fā)現(xiàn)自噬小體的存在，當(dāng)用Con A（伴刀豆球蛋白A，能使得液泡酸化，并防止自噬小體降解）處理，發(fā)現(xiàn)自噬小體在靠近萌發(fā)孔的液泡中富集。在光學(xué)顯微鏡下，利用標(biāo)記自噬小體的ATG8特異性抗體進(jìn)行免疫檢測(cè)顯示，自噬小體在萌發(fā)孔處有明顯的點(diǎn)狀聚集。RT-qPCR也顯示在萌發(fā)一小時(shí)后，大多數(shù)自噬相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，隨后下調(diào)，暗示自噬參與了花粉萌發(fā)的過(guò)程。

?Assessment of autophagic ?ux in germination aperture? ??

Immuno-fluorescenceof germination aperture using the ATG8 (red) antibody

Expressionpattern of ATGs during the process ofpollen germination

? ? ?為了證明自噬確實(shí)參與了花粉萌發(fā)的過(guò)程，那就干掉他。于是他們就用了自噬的抑制劑3-MA，是磷脂酰肌醇3-激酶（PtdIns3K）抑制劑體外處理花粉萌發(fā)。發(fā)現(xiàn)用抑制劑處理過(guò)后的花粉的確不大萌發(fā)。而且抑制劑處理萌發(fā)具有劑量效應(yīng)（定性實(shí)驗(yàn)）。隨后利用ATG8的抗體去標(biāo)記自噬小體，發(fā)現(xiàn)加入3-MA后，自噬小體的形成的確變少（約70%）（定量實(shí)驗(yàn)）。至此，可以的確說(shuō)，自噬的確參與了花粉萌發(fā)的過(guò)程。

Autophagyinhibitor 3-MA? inhibit pollen germination? ??

?Frequencies of pollen germination? ? ?

?3-MA inhibit autophagosomeformation in germination aperture

? ? ? 為了進(jìn)一步探究自噬在花粉萌發(fā)過(guò)程起的作用，作者將正常的花粉萌發(fā)的狀態(tài)與用3-MA的處理的花粉萌發(fā)做對(duì)比。發(fā)現(xiàn)3-MA處理過(guò)程，萌發(fā)孔附進(jìn)會(huì)形成凸起的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且與其他細(xì)胞質(zhì)顯著不同。作者認(rèn)為自噬的活性主要是為了去除這個(gè)凸起的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)。

a convex layer of cytoplasm

? ? ? 在先前的研究中已經(jīng)知道自噬的活性是與ATG這個(gè)家族的基因有關(guān)，于是作者開始探究機(jī)制。于是作者篩選了三個(gè)單拷貝ATG2,ATG5以及ATG7這三個(gè)基因進(jìn)行探究（不是PtdIns3K復(fù)合體），并分別構(gòu)建RNAi的載體。發(fā)現(xiàn)ATG2，ATG5以及ATG7（在附件里）的表達(dá)下調(diào)的確造成了花粉萌發(fā)率的下降，這與3-MA處理的表型很類似。并且ATGs的下調(diào)并不會(huì)導(dǎo)致花粉活力的下降但是只有約30%-50%的花粉能萌發(fā)。

?Expression level of ATG2 or ATG5

The frequencies of pollen germination

The frequencies of pollen germination

Silencingof ATGs did not destroy pollenviability

? ? ? 下面的工作重心無(wú)疑是探究花粉萌發(fā)的失敗與ATGs導(dǎo)致的自噬關(guān)系到底是怎么樣的？作利用自噬水平評(píng)估的ATG8和ATG13作為報(bào)告子進(jìn)行Western blot，可以看出ATG8和ATG13在RNAi的植物中表達(dá)量下調(diào)，暗示著當(dāng)其中一個(gè)基因表達(dá)下調(diào)時(shí)，自噬水平將會(huì)被下調(diào)。利用免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在RNAi的植株中，自噬小體的數(shù)目明顯減少，為了區(qū)別自噬小體的減少到底時(shí)形成減少還是快速降解，利用Con A也不能使得自噬小體的數(shù)目恢復(fù)到野生型的水平，說(shuō)明ATGs參與的是自噬小體的形成，利用crispr突變體atg5。進(jìn)一步說(shuō)明了的確是自噬小體形成出了問(wèn)題。

ATG protein levels

Immuno-fluorescence ofgermination aperture of pollen

Immuno-fluorescence ofgermination aperture of pollen of atg5 mutant

? ? ? 為了進(jìn)一步探究自噬小體的形成與ATGs的關(guān)系，作者利用ATG8的脂化程度進(jìn)行分析，因?yàn)檫@對(duì)于自噬小體的形成是必不可少的。從WT和ATGs-RNAi的花粉中收集了所有的膜組分，然后在PLD（磷脂酶D）預(yù)處理之前或之后通過(guò)免疫印跡分析測(cè)定了ATG8的脂化作用。 在SDS-PAGE后，通常在免疫印跡中檢測(cè)到ATG8–PE的遷移帶比ATG8更快?？梢钥吹揭吧徒?jīng)過(guò)處理后跑的更快，證實(shí)它們是脂化的ATG8?？墒窃贏TGs-RNAi的植物中，ATG脂化程度下降至一般一下。并且在ATGs-RNAi的植物中，也發(fā)現(xiàn)萌發(fā)孔處有凸起的細(xì)胞質(zhì)層,并且對(duì)其面積進(jìn)行了定量化。

immunoblot

Relative ATG8–PE levels?

a convex cytoplasm layer in RNAi line

? ? ? ?為了探索花粉萌發(fā)初期自噬與脂質(zhì)之間的關(guān)系，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）對(duì)野生型和ATG RNAi植物的花粉進(jìn)行脂質(zhì)組分析。在野生型和ATG沉默的花粉中鑒定并定量了幾類鞘脂，磷脂和甘油脂。潛在結(jié)構(gòu)的正交投影-鑒別分析（OPLS-DA）顯示了WT和ATG_RNAi系之間的明顯分離，表明各個(gè)ATG RNAi系的脂質(zhì)組成存在明顯差異。隨后對(duì)于參與自噬的脂類進(jìn)行詳細(xì)分析，三種磷脂： phosphatidylinositol (PI), phatidylethanolamine(PE) 和phosphatidyl-choline參與自噬小體的形成，其中PI能在自噬小體成核過(guò)程中被VPS34磷酸化形成PtdIns3K，其表達(dá)水平在RNAi的植株中大大降低。此外在ATGs_RNAi的花粉中，分別為囊泡成核和吞噬細(xì)胞擴(kuò)張所必需的PE和磷脂酰膽堿的表達(dá)水平也降低了，同時(shí)伴隨著一些溶血PEs（LysoPE）和溶血磷脂酰膽（lysophosphatidylcholine）的表達(dá)水平升高。

? ? ? ? 此外在哺乳動(dòng)物中，鞘脂的外源性神經(jīng)酰胺（Cer）能夠通過(guò)抑制氨基酸攝取并誘導(dǎo)BECN1 / Beclin1的表達(dá)來(lái)激活自噬，即酵母VPS30 / ATG6的哺乳動(dòng)物直系同源物。 有趣的是，ATGs_RNAi的花粉中的Cer水平顯著高于野生型。從內(nèi)部線粒體重新分布到外部線粒體表面的磷脂心磷脂（CL）對(duì)于受損線粒體的自噬是至關(guān)重要的。 相對(duì)于野生型，RNAi植物中的花粉中CL積累至較高水平。磷脂酰甘油（CL合成的重要底物）也積累在ATGs_RNAi的花粉中。 同理，與WT相比，在ATGs_RNAi的花粉中溶血磷脂酰甘油（用于合成磷脂酰甘油的前體）的水平也增加了。三?；视停═AG）是許多植物花粉粒中脂質(zhì)體內(nèi)存儲(chǔ)的主要成分。 抑制自噬可能導(dǎo)致植物和哺乳動(dòng)物體內(nèi)脂質(zhì)的增加。所以，作者重點(diǎn)研究了TAG和二?；视停―AG，TAG合成中的中間代謝物）的組成。 在ATGs_RNAi中均觀察到TAG和DAG的大量積累。 有趣的是，一種的兩親脂質(zhì)亞類，ω-羥基脂肪酸，在自噬缺陷型花粉中也積累了較高的水平。以上研究說(shuō)明自噬導(dǎo)致的膜組分的變化保證花粉的正常萌發(fā)。

OPLS-DA of lipid levels

Levels of phosphatidylinositol (PI) decreased

Heat map shows the relative PE and LysoPE (LPE) levels

Inhibition of autophagy leads tothe increase of Cer?

Inhibition of autophagy leads tothe increase of CL and TAG?

? ? ? ? 最后作者利用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)記（TMT）進(jìn)行定量質(zhì)譜分析，探尋ATG2和ATG5下游蛋白表達(dá)的變化。其中4.3% 和2.8%在ATG2- 和 ATG5-silenced pollen中上調(diào)， 2.6% 和2.8% 下調(diào)。所以作者認(rèn)為自噬途徑對(duì)于花粉的蛋白組來(lái)說(shuō)具有重要作用。且ATG2_RNAi和ATG5_RNAi中up和down存在較多的overlap可能調(diào)控了共同的途徑。但是GO分析顯示，ATG2主要富集含核糖體蛋白和核糖核蛋白相關(guān)組分，而ATG5富集含肽酶和蛋白酶體相關(guān)組分，表明其功能的差異性。在細(xì)胞組分方面，我們可以發(fā)現(xiàn)線粒體質(zhì)子運(yùn)輸ATP合酶復(fù)合物相關(guān)的蛋白下調(diào)明顯，細(xì)胞膜組分上調(diào)明顯。生物學(xué)過(guò)程中，下調(diào)的蛋白富集于細(xì)胞氮化合物的生物合成過(guò)程和ATP合成與質(zhì)子運(yùn)輸耦合，而上調(diào)的蛋白富集于小GTPase介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此作者認(rèn)為，ATG2和ATG5主要通過(guò)線粒體ATP與蛋白質(zhì)合成途徑來(lái)影響花粉萌發(fā)。為了證實(shí)這一結(jié)果，作者還鑒定富集的途徑，發(fā)現(xiàn)上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)都被歸類為與氧化磷酸化有關(guān)的途徑。

Venn diagrams

Volcano plot

Go analyse D cc E bp F Enriched pathways

? ? ? ?這篇文章揭示了自噬是如何參與花粉萌發(fā)的過(guò)程，并且揭示其對(duì)于脂質(zhì)組分的影響以及下游蛋白的影響。但是這些ATG蛋白似乎能在花粉萌發(fā)過(guò)程中起作用，似乎冗余，但是每個(gè)RNAi的植株都有表型，這讓我感覺(jué)到很奇怪，如果能做個(gè)雙突變或者三突是不是更好。此外，其余在花粉萌發(fā)過(guò)程中的表達(dá)有變化的ATG其功能是什么？還有待進(jìn)一步挖掘。