引言

上一篇《相分離研究入門（一）：如何從序列特征預(yù)測你的蛋白能否發(fā)生相分離？ - 簡書》，我們先把理論基礎(chǔ)和生信初篩講清楚了，幫大家鎖定了那些“看起來很有戲”的蛋白序列。但話說回來，生信預(yù)測終究只是“猜”，離“實(shí)錘”還差著十萬八千里。

為什么必須補(bǔ)上體外實(shí)驗(yàn)這一環(huán)？道理很簡單：細(xì)胞里面太亂了。大分子擠成一團(tuán)，各種互作伙伴、翻譯后修飾交織成網(wǎng)。你在顯微鏡下看到一個(gè)熒光亮點(diǎn)，根本沒辦法判它是真的液態(tài)相分離，還是蛋白單純聚成了一團(tuán)垃圾？

體外重構(gòu)實(shí)驗(yàn)的邏輯，恰好相反：用還原論的辦法，把其他變量統(tǒng)統(tǒng)拿掉——沒有擁擠試劑，沒有伴侶蛋白，沒有復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境。在自己配制的緩沖體系里，看提純出來的那個(gè)蛋白會不會自發(fā)形成液滴。如果能，這就不是什么“相關(guān)性”，而是最核心的因果證據(jù)。今天我們繼續(xù)完整拆解體外相分離實(shí)驗(yàn)的全流程，主要包括四個(gè)環(huán)節(jié)：

(1)重組蛋白的表達(dá)與純化——怎么做才能拿到“干凈、能用”的蛋白

(2)相分離的誘導(dǎo)條件摸索——鹽、濃度、crowding?agent，怎么調(diào)

(3)液滴特性表征——DIC形態(tài)、FRAP流動性、濁度法定量

(4)相圖構(gòu)建——測Csat，畫出真正的相邊界

每一步，我都會講清楚操作要點(diǎn)和判定標(biāo)準(zhǔn)。做好準(zhǔn)備，咱們進(jìn)實(shí)驗(yàn)室。

01?實(shí)驗(yàn)前提：高活性重組蛋白的制備與質(zhì)控

做體外重構(gòu)，第一步就是拿到高質(zhì)量的重組蛋白。但相分離蛋白自組裝和聚集傾向極強(qiáng)，如果蛋白制備這個(gè)環(huán)節(jié)出了問題，后面所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都不可信。

（一）重組蛋白的表達(dá)與純化核心規(guī)范

1.載體構(gòu)建與標(biāo)簽選擇

優(yōu)先選擇帶有強(qiáng)促溶標(biāo)簽的表達(dá)載體，比如GST、MBP標(biāo)簽，能顯著降低蛋白在表達(dá)過程中形成包涵體的概率；同時(shí)別忘了在標(biāo)簽與目標(biāo)序列之間加上特異性蛋白酶酶切位點(diǎn)，后面是要切掉的。

注意大分子量的折疊標(biāo)簽會鬧出大問題！以GST（26kDa）為例，它會產(chǎn)生嚴(yán)重的空間位阻，直接干擾IDR之間的弱多價(jià)相互作用。所以最終的相分離實(shí)驗(yàn)，一定要用切除標(biāo)簽后的"裸蛋白"來做。如果你需要熒光標(biāo)記，也請?jiān)谇型陿?biāo)簽之后再用小分子熒光染料去偶聯(lián)。

2.蛋白誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)BL21（DE3）感受態(tài)后，記住一個(gè)原則：低、慢、冷。

在低OD值（OD600=0.3–0.6）時(shí)加入低濃度IPTG（0.2mM及以下），然后在16–18°C的低溫環(huán)境下慢慢誘導(dǎo)過夜。

低溫慢誘導(dǎo)能讓新生肽鏈有充足的時(shí)間正確折疊，最大程度減少錯誤折疊和非特異性沉淀。

3.純化緩沖液的配方設(shè)計(jì)

相分離蛋白的溶解度對鹽濃度、pH值極度敏感，裂解與純化緩沖液需滿足以下核心要求：

采用中性pH體系（如20mM?Tris-HCl，pH7.4），避免pH偏離生理范圍導(dǎo)致蛋白變性；

加入高濃度NaCl（500mM及以上），通過屏蔽靜電相互作用抑制蛋白在純化過程中發(fā)生過早相分離或聚集；

加入10%甘油穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)，新鮮添加蛋白酶抑制劑、還原劑（β-巰基乙醇或DTT），防止蛋白降解與二硫鍵錯配。

4.標(biāo)簽切除與終產(chǎn)物質(zhì)控

親和層析抓到目標(biāo)蛋白后，直接在樹脂上進(jìn)行原位酶切，4°C旋轉(zhuǎn)孵育至少4小時(shí)，確保標(biāo)簽徹底切干凈。

洗脫后的蛋白要通過SDS-PAGE驗(yàn)證純度（純度要達(dá)到95%以上），同時(shí)用動態(tài)光散射（DLS）檢查蛋白有沒有預(yù)先聚集?——必須確認(rèn)蛋白以單體形式存在后，再分裝凍存于-80°C，而且盡量避免反復(fù)凍融。

02?相分離的誘導(dǎo)與初步篩選

蛋白準(zhǔn)備好了，接下來就是找條件——摸索能讓你的蛋白發(fā)生相分離的臨界條件。

（一）相分離的核心誘導(dǎo)條件

生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)是大分子高度擁擠的環(huán)境，總濃度可達(dá)200–400mg/mL。而在體外，你的蛋白濃度通常只在微摩爾級別，差了好幾個(gè)數(shù)量級。

所以需要通過以下手段來"模擬"胞內(nèi)的擁擠環(huán)境，誘導(dǎo)相分離發(fā)生：

①?大分子擁擠試劑：最常用的誘導(dǎo)方式，優(yōu)先選擇PEG-8000、Dextran、Ficoll等惰性擁擠試劑，終濃度通常為5%-15%，通過體積排阻效應(yīng)提升蛋白的有效濃度，驅(qū)動相分離發(fā)生；

②?鹽濃度調(diào)控：通過降低體系中的NaCl濃度，增強(qiáng)蛋白間的靜電相互作用，是調(diào)控相分離的核心變量，通常設(shè)置50-500mM的NaCl濃度梯度；

③?蛋白濃度梯度：相分離存在明確的飽和濃度閾值，需設(shè)置5-50μM的蛋白終濃度梯度，明確臨界濃度；

④?其他調(diào)控因素：pH值、溫度、RNA/核酸等互作分子、蛋白翻譯后修飾，均可顯著影響相分離行為，需根據(jù)目標(biāo)蛋白的生物學(xué)特性針對性設(shè)置梯度。

（二）濁度法：最簡便的初步篩選手段

當(dāng)?shù)鞍兹芤喊l(fā)生相分離時(shí)，濃相液滴的形成會導(dǎo)致光散射顯著增加，表現(xiàn)為OD340或OD600處吸光度的上升，這是濁度法的核心原理，也是體外相分離最快速的初篩方法。

??標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：

①?在96孔板中設(shè)置不同條件的反應(yīng)體系，總體系通常為100-200μL，每個(gè)條件設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白緩沖液對照與陰性對照蛋白；

②?輕柔混勻體系后，37℃孵育5-10分鐘，使用酶標(biāo)儀檢測340nm或600nm處的吸光度值；

③?以蛋白濃度、鹽濃度、擁擠試劑濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制相分離誘導(dǎo)曲線，明確臨界誘導(dǎo)條件。

03?相分離液滴的多維表征與液態(tài)屬性驗(yàn)證

通過濁度法完成初篩后，必須通過多維度的實(shí)驗(yàn)表征，驗(yàn)證體系中形成的是相分離液態(tài)液滴，而非固態(tài)蛋白聚集體，這是體外實(shí)驗(yàn)的核心判定環(huán)節(jié)。

（一）微分干涉相差（DIC）顯微鏡：直接的形態(tài)學(xué)證據(jù)

濁度法只告訴你"散射增加了"，而DIC顯微鏡能讓你親眼看到液滴長什么樣、有什么動態(tài)行為——這是判斷相分離最核心的形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1.標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：

①?將孵育后的相分離反應(yīng)體系滴加到載玻片或玻璃底培養(yǎng)皿上，加蓋蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡；

②?在DIC模式下，使用40倍及以上的物鏡觀察，記錄不同時(shí)間點(diǎn)的圖像，重點(diǎn)觀察液滴的形態(tài)與動態(tài)行為。

2.相分離液滴的核心判定標(biāo)準(zhǔn)：

形態(tài)規(guī)則，呈完美球形：這是液滴最小化表面張力的熱力學(xué)必然結(jié)果，尺寸通常在0.5–20μm；

能融合：兩個(gè)液滴接觸后，會在極短時(shí)間內(nèi)自發(fā)融合成一個(gè)更大的球形液滴，如果能拍到融合過程的視頻，那是液態(tài)特性的鐵證；

能潤濕：液滴碰到玻片等固體邊界時(shí)，會浸潤鋪展成半球狀，而不是像剛性球一樣彈開。

（二）熒光恢復(fù)光漂白（FRAP）：液滴內(nèi)部流動性的金標(biāo)準(zhǔn)

光漂白后熒光恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，是驗(yàn)證液滴內(nèi)部分子動態(tài)性與液態(tài)屬性的核心手段，可直接區(qū)分液態(tài)液滴、凝膠與固態(tài)聚集體。

1.標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：

①?將熒光標(biāo)記的目標(biāo)蛋白納入相分離體系，制備顯微觀察樣本；

②?在共聚焦顯微鏡下，選擇形態(tài)規(guī)則的球形液滴，用高強(qiáng)度激光漂白其中一小塊區(qū)域，然后以固定時(shí)間間隔連續(xù)成像，記錄漂白區(qū)域的熒光恢復(fù)過程，一直拍到恢復(fù)進(jìn)入平臺期為止。

2.結(jié)果判定與關(guān)鍵參數(shù)：

液態(tài)液滴的核心特征：漂白區(qū)的熒光在數(shù)秒到數(shù)十秒內(nèi)快速且?guī)缀跬耆謴?fù)，說明液滴內(nèi)部的分子具有高度流動性，能快速交換；

兩個(gè)關(guān)鍵定量參數(shù)：

①?移動分?jǐn)?shù)：恢復(fù)到平臺期時(shí)的熒光強(qiáng)度占初始強(qiáng)度的比例。純液態(tài)液滴的移動分?jǐn)?shù)通常>70%；如果<30%，不能認(rèn)定為液態(tài)相分離；

②?恢復(fù)半衰期：熒光恢復(fù)到可恢復(fù)最大值50%所需的時(shí)間，直接反映分子擴(kuò)散速率，液態(tài)液滴通常在秒級。

3.避坑重點(diǎn)：

僅憑熒光恢復(fù)不足以作為相分離的診斷依據(jù)，非特異性聚集也可能出現(xiàn)類似的恢復(fù)模式，必須結(jié)合DIC顯微鏡的形態(tài)與融合證據(jù)綜合判斷；

FRAP分析的模型選擇對結(jié)果影響極大，不當(dāng)?shù)哪Ｐ图僭O(shè)會顯著誤導(dǎo)擴(kuò)散系數(shù)的估算，需根據(jù)液滴的大小、漂白區(qū)域的幾何構(gòu)型選擇適配的數(shù)學(xué)模型；

需設(shè)置液滴外的彌散區(qū)域作為對照，排除光漂白對熒光基團(tuán)的不可逆損傷。

（三）沉降法與相圖構(gòu)建：相分離的熱力學(xué)定量證據(jù)

看到液滴是定性結(jié)果，而要精準(zhǔn)界定相分離這一熱力學(xué)過程，必須通過離心沉降實(shí)驗(yàn)測定飽和濃度并構(gòu)建完整的相圖。

1.核心原理：

飽和濃度（Csat）是相分離的核心熱力學(xué)參數(shù)。蛋白濃度低于Csat時(shí)，體系是均一的單相；一旦超過Csat，體系自發(fā)分成濃相和稀相，而稀相的蛋白濃度始終維持在Csat。測定不同條件下的Csat，就能繪制出區(qū)分單相區(qū)和兩相區(qū)的雙節(jié)點(diǎn)曲線——也就是相圖。

2.標(biāo)準(zhǔn)化操作流程：

①?配置不同條件的相分離反應(yīng)體系，孵育至相分離平衡后，高速離心（通常16000×g，10分鐘）使?jié)庀嗯c稀相分離；

②?分別收集上清液（稀相）與沉淀（濃相），通過BCA、分光光度法或SDS-PAGE定量測定兩相的蛋白濃度；

③?稀相的蛋白濃度即為該條件下的Csat，通過改變蛋白濃度、鹽濃度、溫度、擁擠試劑濃度等參數(shù)，獲得一系列相變點(diǎn)，擬合繪制完整的相圖。

04體外實(shí)驗(yàn)的高頻陷阱與陰性結(jié)果應(yīng)對

①　最常見的假陽性：把蛋白沉淀/聚集當(dāng)成相分離

固態(tài)聚集體在顯微鏡下也可能呈現(xiàn)點(diǎn)狀信號，但其核心區(qū)別是：無規(guī)則球形形態(tài)、不發(fā)生融合、FRAP熒光幾乎不恢復(fù)。必須同時(shí)滿足“球形形態(tài)+融合行為+快速FRAP恢復(fù)”三大核心特征，才能判定為液態(tài)相分離。

②　實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)陰性結(jié)果怎么辦？

如果沒看到相分離，按以下優(yōu)先級排查：

? 蛋白是不是降解了或者預(yù)先聚集了？重新做蛋白制備和質(zhì)控；

??體系鹽濃度是不是太高了？逐步降低NaCl濃度，增強(qiáng)分子間相互作用；

??擁擠試劑濃度是不是不夠？提高PEG-8000等試劑的終濃度；

??你的蛋白是不是需要"伙伴"?——?比如RNA、伴侶蛋白，才能驅(qū)動相分離？把對應(yīng)的互作分子補(bǔ)進(jìn)去；

??是不是需要特定翻譯后修飾？用體外修飾體系先把蛋白修飾好再去做實(shí)驗(yàn)。

③　對照設(shè)置的核心規(guī)范

所有實(shí)驗(yàn)必須設(shè)置嚴(yán)格的陰性對照，包括單獨(dú)的標(biāo)簽蛋白、已證實(shí)無相分離能力的球狀蛋白，在完全相同的條件下進(jìn)行測試，排除緩沖體系、標(biāo)簽、熒光染料等因素導(dǎo)致的假陽性結(jié)果。

小結(jié)

好了，到這里，體外重構(gòu)實(shí)驗(yàn)這一塊就基本講清楚了。咱們快速回顧一下核心邏輯：

從高純度蛋白制備，到相分離條件的系統(tǒng)篩選，再到液滴形態(tài)、流動性、飽和濃度的多維表征，最終構(gòu)建出完整的相圖——這一整套流程做下來，你就能非常扎實(shí)地回答一個(gè)問題：我的蛋白，到底有沒有“內(nèi)在”的相分離能力？這是整個(gè)相分離研究中最不可動搖的硬證據(jù)，也是后續(xù)所有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和功能研究的基礎(chǔ)。

那下一步呢？當(dāng)然是從試管里走出來，回到活細(xì)胞中。畢竟，體外能分，不代表細(xì)胞內(nèi)真會分；細(xì)胞內(nèi)分了，也不代表它真的有功能。下一篇，我們就來重點(diǎn)講：

??活細(xì)胞成像與胞內(nèi)FRAP怎么做、怎么判；

??1,6-己二醇到底該怎么用；

??光遺傳學(xué)工具如何幫你實(shí)現(xiàn)“指哪打哪”的相分離操控；

從試管到細(xì)胞，一步一個(gè)腳印。下一篇見。

參考資料

1.?Zhang?Y,?Shen?L.?An?in?vitro?assay?to?probe?the?formation?of?biomolecular?condensates.?Bio-protocol.?2023;13(17):e4813?.?

2.?Ceballos?AV,?McDonald?CJ,?Elbaum-Garfinkle?S.?Methods?and?strategies?to?quantify?phase?separation?of?disordered?proteins.?Methods?Enzymol.?2018;611:31-50?.?

3.?Hedtfeld?M,?Musacchio?A.?Protocol?for?validating?liquid-liquid?phase?separation?as?a?driver?of?membraneless?organelle?assembly?in?vitro?and?in?human?cells.?STAR?Protoc.?2024;5:103410?.

4.?Arter?WE,?Qi?R,?Krainer?G,?et?al.?Rapid?generation?of?protein?condensate?phase?diagrams?using?combinatorial?droplet?microfluidics.?bioRxiv.?Preprint?posted?online?June?10,?2020?.?

5.?Pedraza?E,?Tejedor?AR,?Feito?A,?et?al.?Predicting?saturation?concentrations?of?phase-separating?proteins?via?thermodynamic?integration.?bioRxiv.?Preprint?posted?online?May?14,?2025?.?

6.?M?ller?J.?Liquid-Liquid?Phase?Separation?and?Intermolecular?Interactions?in?Dense?Protein?Solutions:?High?Pressure?SAXS?Studies?on?Lysozyme?Solutions?of?High?Ionic?Strength?[dissertation].?Technische?Universit?t?Dortmund;?2014.