Science | 張峰：利用RNA來定位DNA位置的蛋白的數(shù)量和種類可能遠超想象

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撰文：驕陽似我

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1.?本文從IS200/IS605轉(zhuǎn)座子重建了CRISPR-Cas9系統(tǒng)的進化，發(fā)現(xiàn)IscB使用單個非編碼RNA進行RNA引導的雙鏈DNA切割并且可以用于人類細胞中的基因組編輯。還證明了TnpB的RNA引導的核酸酶活性，另一種IS200/IS605轉(zhuǎn)座子編碼的蛋白質(zhì)和Cas12內(nèi)切核酸酶的可能祖先。

2.?這項工作揭示了一類廣泛的轉(zhuǎn)座子編碼的RNA引導的核酸酶，本文將其命名為OMEGA（專性移動元件引導活性），具有作為生物技術(shù)發(fā)展的巨大潛力。

IscB蛋白是在IS200/IS605轉(zhuǎn)座子的不同家族中編碼的推定核酸酶，可能是RNA引導的核酸內(nèi)切酶Cas9的祖先，但IscB的功能及其與任何RNA的相互作用仍未表征。原核RNA引導的防御系統(tǒng)CRISPR-Cas9（II型CRISPR-Cas）已被用于真核細胞中的基因組編輯，被認為是從IscB蛋白進化而來的。盡管其在原核生物中廣泛分布并且與Cas9共享域組成和體系結(jié)構(gòu)，但IscB的功能仍然未知。此外，鑒于尚未報道IscB與非編碼RNA（ncRNA）或CRISPR陣列相關(guān)，Cas9系統(tǒng)中RNA引導活性的進化起源尚不清楚。

近期，在Science雜志上發(fā)表了一篇名為“The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases”的文章，使用系統(tǒng)發(fā)育分析，RNA測序（RNA-seq）和生化實驗，試圖闡明這些蛋白質(zhì)的功能以及2類CRISPR系統(tǒng)中RNA引導活性的起源。

IscB長約400個氨基酸，含有通過插入橋螺旋（BH）和HNH內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域分裂的RuvC內(nèi)切核酸酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)與Cas9共享。對含有HNH或分裂RuvC核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)進行了全面搜索，發(fā)現(xiàn)Cas9和IscB是唯一含有兩個結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。還顯示IscB含有先前未鑒定的N末端，其與已知結(jié)構(gòu)域缺乏明顯的同源性，并且在Cas9中不存在，在其保守序列基序后表示PLMP。RuvC，BH和HNH結(jié)合域的聚類和系統(tǒng)發(fā)育分析強烈表明，所有現(xiàn)存的Cas9都來自單個祖先IscB。從每個簇中搜索與IscB基因相鄰的CRISPR陣列，發(fā)現(xiàn)了六個不同的IscB組，包含16個簇（共603個），與CRISPR相關(guān)，與以前的觀察相反。CRISPR相關(guān)的IscB分散在IscB系統(tǒng)發(fā)育樹周圍，這表明它們獨立進化，一個關(guān)聯(lián)事件導致Cas9譜系?？偣茶b定了31個獨特的CRISPR相關(guān)iscB基因座（共2811個）。首先檢查了一組CRISPR相關(guān)的ISCB，類似于非CRISPR相關(guān)的ISCB（氨基酸同一性約為50%）。在大腸桿菌中異源表達來自該進化枝的代表性基因座并進行小RNA-seq，其顯示不僅CRISPR陣列的表達，而且CRISPR陣列和IscB開放閱讀之間的329堿基對（bp）基因間區(qū)域框架（ORF）。本文還純化了IscB蛋白并對共純化的RNA進行了測序，證明該蛋白與包含CRISPR陣列和該基因間區(qū)域的單個ncRNA組分相互作用。鑒于其與包含CRISPR直接重復（DR）和間隔區(qū)的ncRNA的相互作用，以及其與Cas9類似的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，測試了該IscB的RNA引導的核酸內(nèi)切酶活性。使用先前建立的原型間隔區(qū)相鄰基序（PAM）-發(fā)現(xiàn)測定，觀察到特定PAM序列的消耗，表明CRISPR相關(guān)的ISCB是可重編程的RNA引導的核酸酶。發(fā)現(xiàn)IscB至少在功能上與CRISPR相關(guān)，并且可能在其他情況下，表明IscB系統(tǒng)更一般地共享核心祖先ncRNA基因，該基因易于進化成CRISPR陣列，并且在某些情況下是單獨的反式激活CRISPR RNA。為了驗證這一假設(shè)，比對了563個非冗余iscB基因座，并在iscB ORF的上游或下游搜索保守核苷酸（nt）序列。該分析揭示了ORF上游長度約300bp的高度保守的基因間區(qū)域，其5'末端的保守性下降，這對應(yīng)于IS200/IS605轉(zhuǎn)座子末端。共有CRISPR相關(guān)的IscB ncRNA和協(xié)方差折疊的RNA二級結(jié)構(gòu)的比較揭示了高度的結(jié)構(gòu)和序列相似性，特別是在共享的多干區(qū)域和假結(jié)中。推斷wRNA中5'-最不保守的序列可能起指導序列的作用，因為預測緊鄰下游的序列形成發(fā)夾，其結(jié)構(gòu)類似于CRISPR相關(guān)IscB中DR/抗重復雙鏈體形成的發(fā)夾ncRNA。圖1：IscB與進化上保守的非編碼RNA相關(guān)。

為了檢測IscB是否能夠切割與假定的wRNA指南互補的DNA，使用體外轉(zhuǎn)錄/翻譯（IVTT）表達系統(tǒng)用KraIscB-1進行了體外質(zhì)粒切割試驗。發(fā)現(xiàn)KraIscB-1以wRNA依賴性方式切割靶標，具有ATAAA 3'靶標鄰接基序（TAM）。使用不同的指南（Fn指南）重新定位KRAISCB-1切割同源靶標，暗示IscB是可重編程的RNA引導的核酸酶。接下來在體外對IscB進行了生物化學表征。我們通過鑒定TAM確定了86個（66%）選擇的系統(tǒng)發(fā)育不同系統(tǒng)中的57個的活性。在這57個功能性ISCB中，5個可以在體外用相應(yīng)的wRNA重建以實現(xiàn)有效的靶標切割，并且從中選擇了AwaIscB用于詳細的生物化學表征。證實了重組AwaIscB以可編程方式切割多個雙鏈DNA（dsDNA）靶標的能力，并顯示AwaIscB的活性依賴于鎂，最適溫度為35°至40°C。催化RuvC II殘基（E157A）的突變消除了對非靶DNA鏈的核溶解活性，而HNH結(jié)構(gòu)域催化突變體H212A消除了對靶鏈的核溶解活性。E157A和H212A突變（dAwaIscB）的組合消除了所有dsDNA核酸分解活性。切割產(chǎn)物的測序顯示AwaIscB切割TAM上游3nt的靶鏈，類似于Cas9。非靶鏈的切割發(fā)生在TAM上游8或12 nt，產(chǎn)生長度為5或9 nt的5'突出端。圖2：IscB是可重編程的RNA引導的DNA內(nèi)切核酸酶。

RNA引導系統(tǒng)的顯著優(yōu)點是它們允許效應(yīng)子通過簡單地重編程RNA指導來靶向許多底物。IscB發(fā)展為使用多個指南的一種方法是與CRISPR陣列相關(guān)聯(lián)。鑒于iscB基因座通常編碼單個wRNA，因此不清楚這些系統(tǒng)通常如何或甚至是否實現(xiàn)這種模塊化。通過搜索不直接與iscB ORF相鄰的wRNA，發(fā)現(xiàn)了三種用于指導編碼和切換的額外潛在機制：wRNA陣列，轉(zhuǎn)座子擴增和獨立的反式作用wRNA。wRNA陣列由多個wRNA組成，每個wRNA包含不同的指導，間隔高達200bp，并且在3356個獨特的IscB/IsrB基因座中的15個（0.4%）中發(fā)現(xiàn)。轉(zhuǎn)座子擴增涉及在多個位置插入幾乎相同的IS200/IS605超家族轉(zhuǎn)座子，導致每個基因組有多個基因座，每個基因座能夠用獨特的指導表達幾乎相同的wRNA支架。相比之下，獨立的wRNA更常見，并且在一些基因組中以多拷貝發(fā)現(xiàn)，其顯示與iscB沒有可檢測的基因組關(guān)聯(lián)。來自3356個獨特IscB/IsrB基因座中的95個（2.8%）的順式-wRNA幾乎相同(≥95%序列同一性）到遠端編碼的獨立wRNA，這意味著這些獨立的wRNA可以編碼反式編碼的ISCB使用的指導。通過檢查K.racemifer基因組中的10個獨立的wRNA來測試這種可能性，其中9個被發(fā)現(xiàn)表達。在測試的6個獨立的wRNA中，發(fā)現(xiàn)5個可以用來自相同基因組的遠端編碼的IscB介導RNA引導的DNA切割，證明單個IscB可以使用多個反式編碼的wRNA。來自許多wRNA的指導，包括IscB相鄰和反式編碼，主要靶向原核基因組序列，表明IscB系統(tǒng)具有非缺失功能。圖3：IscB使用多種指導編碼機制。

接下來研究了IscB，Cas9和其他同源蛋白之間的進化關(guān)系，以更廣泛地了解RNA引導機制的進化。在尋找包含分裂的RuvC結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)時，檢測到另一組較短的?350個氨基酸的IscB同源物，它們也編碼在IS200/IS605超家族轉(zhuǎn)座子中。這些蛋白質(zhì)含有PLMP結(jié)構(gòu)域和分裂的RuvC，但缺乏HNH結(jié)構(gòu)域。將這些蛋白質(zhì)IsrB（插入序列RuvC-like OrfB）重命名為強調(diào)它們獨特的結(jié)構(gòu)域，取代了之前的名稱IscB1。除了IscB和IsrB之外，還鑒定了僅包含PLMP結(jié)構(gòu)域和HNH結(jié)構(gòu)域但不包含RuvC結(jié)構(gòu)域的更小的蛋白質(zhì)家族（約180個氨基酸），將其命名為IshB（插入序列HNH樣OrfB）。為了研究這些蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，使用IQTREE 2從分裂的RuvC核酸酶和BH結(jié)構(gòu)域的多重比對構(gòu)建了最大似然（ML）樹。在得到的樹中，IsrB，IscB和Cas9形成了獨特的，強烈支持的進化枝，這表明這些核酸酶中的每一個都起源于獨特的進化事件。然后分析了每個蛋白質(zhì)簇與IS200/IS605 tnpA基因，wRNAs，CRISPR-Cas適應(yīng)基因（cas1，cas2，cas4和csn2），相應(yīng)ORF上游和下游的CRISPR陣列之間的關(guān)聯(lián)，以及CRISPR反重復。如上所述，iscB和isrB很少與CRISPR陣列相關(guān)，并且未發(fā)現(xiàn)與CRISPR-Cas適應(yīng)基因相關(guān)。ISRB與結(jié)構(gòu)上不同的wRNA相關(guān)。此外確定了兩個不同的Cas9s組。第一種是新亞型II-D，一組相對較小的cas9s（~700個氨基酸），與任何其他已知的cas基因無關(guān)。第二個是從II-C亞型內(nèi)分支的獨特分支，其包括與tnpA相關(guān)的特別大的cas9s（>1700個氨基酸）。tnpA相關(guān)的II-C基因座通常包含異常長的DR（長度超過42bp），并且在一些情況下編碼cas9和其他cas基因之間的HIRAN結(jié)構(gòu)域蛋白。預測的轉(zhuǎn)座子末端圍繞這些基因座中的tnpA，cas獲取基因和CRISPR陣列的各種組合。這些系統(tǒng)發(fā)育和關(guān)聯(lián)分析證實IS200/IS605轉(zhuǎn)座子編碼的ISCB和ISRB與Cas9具有共同的進化歷史。鑒于IsrB進化枝在樹中的深部位置和缺乏HNH結(jié)構(gòu)域，IsrB可能代表祖先狀態(tài)，可能是從緊湊的RuvC核酸內(nèi)切酶進化而來的。幾乎所有ISRB都與wRNA相關(guān)；這表明這些系統(tǒng)在進化的早期階段成為RNA引導的。IsrB隨后獲得了HNH結(jié)構(gòu)域，可能是通過插入另一個移動元件或與編碼IshB樣蛋白的基因重組，建立了IscB家族。CRISPR陣列出現(xiàn)在IscB系統(tǒng)中多次獨立的場合。這些短陣列由重復序列組成，這些重復序列可以通過復制祖先wRNA的片段而進化。得到的系統(tǒng)包括雜交CRISPR-wRNA，其由部分wRNA之前的CRISPR陣列組成。這些CRISPR相關(guān)的IscB蛋白可能在許多情況下也在RuvC-I和RuvC-II亞結(jié)構(gòu)域之間獲得REC樣插入，通常與CRISPR結(jié)合同時或之后不久。特別是，一個CRISPR相關(guān)的IscB簇（簇2089）可能在標志性PLMP結(jié)構(gòu)域丟失后建立了Cas9家族。此外，亞型II-D的tracrRNA，Cas9子樹中的深分支顯示與IscB wRNA顯著相似，這表明Cas9 tracrRNA最初是從wRNA進化而來的。最后，在與CRISPR適應(yīng)機制（cas1，cas2和可能的cas4）相關(guān)聯(lián)后，Cas9多樣化的爆發(fā)和通過水平基因轉(zhuǎn)移在細菌之間的廣泛分散隨后，導致多種II型CRISPR亞型的進化。我們還探索了wRNA的進化歷史。通過迭代構(gòu)建一組跨越與ISCB和ISRB相關(guān)的所有主要RNA組的wRNA譜，我們發(fā)現(xiàn)不同的wRNA與幾乎所有ISCB和ISRB相關(guān)。此外，不同的IsrB和IscB進化枝與不同的wRNA結(jié)構(gòu)相關(guān)。從isrB到iscB的轉(zhuǎn)變可能伴隨著isrB相關(guān)的wRNA中轉(zhuǎn)座子末端區(qū)域和多莖環(huán)之間的第二個假結(jié)，即銜接子假結(jié)的丟失。wRNA結(jié)構(gòu)的復雜性與相關(guān)蛋白質(zhì)大小之間的反比關(guān)系也反映在與大ISCB的進化枝相關(guān)的簡化的wRNA結(jié)構(gòu)和與大Cas9s相關(guān)的甚至更小的tracrRNA上。圖4：IscB系統(tǒng)的演變與多樣性。

除了產(chǎn)生豐富多樣的II型CRISPR系統(tǒng)的進化事件的獨特連續(xù)性之外，系統(tǒng)發(fā)育分析還揭示了IscB和相關(guān)蛋白進化中的其他幾個事件導致了現(xiàn)存的多樣性。首先在真核生物基因組中搜索了IscB同源物，并在陸地綠藻Ignatius tetrasporus UTEX B 2012的葉綠體基因組中鑒定了多個IscB基因座。盡管ORF在大多數(shù)這些基因座中被多個終止密碼子破壞，但一個基因座編碼完整的IscB（與相關(guān)的原核IscB具有約50%的氨基酸同一性）和轉(zhuǎn)錄活性的wRNA。該真核IscB用最小的NNG TAM切割DNA，其不同于其他表征的IscB TAM。其次研究了大型ISCB的進化枝，其中包含一個BH域，該域通過類似REC域的插入被分成兩部分。假設(shè)這些插入可能會增強DNA解旋，類似于Cas9的REC葉，因此將促進真核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)復雜景觀中的基因組編輯。在人類基因組中的46個位點上，發(fā)現(xiàn)OgeuIscB在28個這些位點誘導插入缺失，效率高達4.4%。因此，OgeuIscB似乎是進一步開發(fā)基于IscB的基因組編輯工具的有希望的候選者。第三，通過實驗表征了IscB的明顯祖先IsrB的假定核酸酶活性。Kracemifer含有5個與天然表達的WRNA相關(guān)的ISRB。發(fā)現(xiàn)IsrB-wRNA RNP以指導和TAM特異性方式切割dsDNA底物的非靶鏈，這類似于IscB的活性。滅活HNH結(jié)構(gòu)域。最后，試圖確定IS200/IS605轉(zhuǎn)座子是否一般含有RNA引導的核酸酶。除了獨特的IscB和IsrB家族外，大多數(shù)IS200/IS605轉(zhuǎn)座子編碼另一個家族的RuvC樣核酸內(nèi)切酶TnpB，它被認為是V型CRISPR效應(yīng)子Cas12s的祖先。此外，TnpB可能是編碼在不同真核轉(zhuǎn)座子中的較大蛋白質(zhì)Fanzors的祖先。先前的工作已經(jīng)鑒定了與古細菌和細菌中tnpB基因的3'末端重疊的ncRNA，但這些ncRNA的功能尚未表征。K.racemifer的小RNA-seq揭示了與相關(guān)tnpB ORF的3'末端重疊的ncRNA的天然表達，將其歸類為不同的wRNA組。KraTnpB wRNA 3'末端的反向互補幾乎與與一些KraIscBs相關(guān)的wRNA的5'相同，該區(qū)域?qū)?yīng)于每個基因座中預測的轉(zhuǎn)座子末端對含有與KraTnpB聚集的tnpB基因的非冗余基因座的分析顯示，在基因座的3'末端，對應(yīng)于IS200/IS605轉(zhuǎn)座子末端，序列保守性下降。與小RNA-seq跡線的比較顯示表達超出保守下降，表明轉(zhuǎn)錄物中可能存在指導序列。使用重編程的指導對來自該簇的多種TnpB蛋白的體外質(zhì)粒切割測定證明了用5'TAM進行RNA引導的切割。從AmaTnpB重組純化TnpB并證實其可重編程的RNA引導的dsDNA內(nèi)切核酸酶活性。在識別dsDNA或ssDNA底物時，AmaTnpB強力切割含有靶的單鏈DNA（ssDNA）底物并且非特異性切割側(cè)枝底物。圖5：IS200/IS605元件編碼多種RNA引導的核酸酶。

通過探索Cas9進化，發(fā)現(xiàn)了三種高度豐富但以前未表征的轉(zhuǎn)座子編碼核酸酶的可編程RNA引導機制：IscB，IsrB和TnpB，統(tǒng)稱為OMEGA（專性移動元件引導活性），因為移動元素的定位和移動可能決定了他們指南的身份。雖然OMEGA系統(tǒng)的生物學功能尚不清楚，但有幾個假設(shè)與現(xiàn)有證據(jù)相符，包括促進TNP催化，RNA引導轉(zhuǎn)座或作為毒素的作用，轉(zhuǎn)座子作為抗毒素，確保維持IS200/IS605插入。

TnpB家族比IscB家族更加豐富和多樣化，在細菌和古細菌基因組中鑒定了超過100萬個推定的tnpB基因座，使其成為最常見的原核基因之一。這些TNPB可能代表了未開發(fā)的豐富的各種RNA引導機制，不僅存在于原核生物中，而且存在于真核生物中。結(jié)合對葉綠體編碼的IscB的鑒定，這些發(fā)現(xiàn)表明RNA引導系統(tǒng)擴展到真核基因組中可能是一種普遍現(xiàn)象，更廣泛地說，RNA引導系統(tǒng)在功能上是多樣的并且滲透到生命的所有領(lǐng)域。

教授介紹：

張峰

張鋒，男，1982年出生于河北石家莊，2004年畢業(yè)于?哈佛大學，2009在斯坦福大學獲得博士學位，是當今最為人所關(guān)注的華裔生物學家之一。他最著名的工作是基因修飾技術(shù)CRISPR-Cas9的發(fā)展和應(yīng)用，率先獲得了美國專利，并被視為諾貝爾獎的熱門人選之一。2021年10月18日，張鋒教授當選美國國家醫(yī)學科學院院士（National Academy of Medicine，NAM）。張鋒主要研究領(lǐng)域為神經(jīng)系統(tǒng)功能與疾病。他在自然微生物CRISPR系統(tǒng)用于真核細胞(包括人類細胞)的基因編輯工具開發(fā)方面做出了最前沿的探索。通過CRISPR及其他方法，張鋒深入研究了基因和遺傳機制與各種疾病的關(guān)聯(lián)，尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)紊亂方面。

張鋒于2011年加入MIT，同時在麥戈文腦科學研究所(McGovern Institute)大腦與認知科學部門，以及博德研究所(Broad Institute)從事科研工作。2013年，他的實驗室開發(fā)出創(chuàng)新性CRISPR/Cas系統(tǒng)，大幅度提高了編輯基因的可靠性和效率，引起國際關(guān)注，因其突破性的研究成果，他獲得了眾多榮譽。2014年，張鋒被《自然》雜志評選為2013年年度十大科學人物之一；2015年，獲得“年度波士頓人”提名；2016年3月，獲得加拿大蓋爾德納國際獎；2016年，第二屆唐獎生技醫(yī)藥獎；2017年，獲得美國布拉瓦尼克國家青年科學家獎。

參考文獻：

HAN?ALTAE-TRAN,SOUMYA?KANNAN,FENG?ZHANG?etal.The widespread IS200/IS605 transposon family encodes diverse programmableRNA-guided endonucleases[J].SCIENCE, 1 Oct 2021,Vol?374,?Issue?6563,pp57-65