In-Fusion方法及引物的設(shè)計(jì)

本章構(gòu)建PHD2的重組表達(dá)載體時(shí)使用的是pET-43.1(+)系列中的pET-43.1b(+)，目的是通過(guò)Nus?Tag促進(jìn)融合蛋白可溶性表達(dá)，His?Tag作為親和標(biāo)簽用于后期目的蛋白的純化。

2.4.2 In-Fusion方法及引物的設(shè)計(jì)

2.4.2.1 In-Fusion Cloning方法? 常用的TA克隆、限制性酶切克隆及平滑末端克隆等方法存在連接效率低、需要特定限制性酶切位點(diǎn)以及耗時(shí)較長(zhǎng)等缺點(diǎn)，In-Fusion Cloning方法旨在用一步法將任意DNA片段克隆到任意線性化載體中，技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)0.05-15kb DNA片段的克隆，還可以同時(shí)克隆兩個(gè)或多個(gè)DNA片段，無(wú)需亞克隆。整個(gè)過(guò)程不附加多余序列，真正意義上實(shí)現(xiàn)了完美的無(wú)縫克隆。

目前，In-Fusion技術(shù)已被應(yīng)用到國(guó)內(nèi)外許多科研工作中。Roger等人使用In-Fusion方法實(shí)現(xiàn)了DNA片段與載體任意位置的無(wú)縫融合，該方法操作簡(jiǎn)便并且易于實(shí)自動(dòng)化。Martina等人用In-Fusion方法將目的基因高效地克隆至一些列載體系統(tǒng)上，表達(dá)出不同的重組單克隆抗體，為早期治療及診斷的評(píng)估奠定了基礎(chǔ)。Chad等人研究發(fā)現(xiàn)牛痘病毒DNA聚合酶可以增大In-Fusion Cloning的反應(yīng)效率，實(shí)現(xiàn)插入序列高通量的定向克隆。在國(guó)內(nèi)，張明娟等人首次報(bào)道了使用In-Fusion技術(shù)將鈉泵α3截?cái)嘈云尾迦雙GEX-6P-1載體中，表達(dá)出GST-Trf-α3融合蛋白。劉超等人發(fā)現(xiàn)用T4 DNA連接酶處理后，不能成功地將較大的SCN1A cDNA基因（6.0Kb）克隆至pCMV-IRES-DsRed（5.2Kb）真核載體上，后來(lái)改用In-Fusion技術(shù)成功地構(gòu)建了pCMV-SCN1A-IRES-DsRed重組載體，實(shí)現(xiàn)了Ⅰ型鈉通道與紅色熒光蛋白的共表達(dá)。韓凱等人也研究發(fā)現(xiàn)In-Fusion是一種通用、快速、高效的構(gòu)建重組表達(dá)載體的方法。

本論文首先通過(guò)限制性酶切法得到線性化載體，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增目的基因使其兩端與線性化載體末端具有15個(gè)同源序列。然后用PrimeSTAR? HS DNA聚合酶（寶生物公司）進(jìn)行PCR反應(yīng)，充分確保了目的基因的高保真性。最后用In-Fusion專(zhuān)利酶將帶有同源序列的目的基因與線性化載體融合，Cloning Enhancer的加入消除了PCR反應(yīng)液中引物二聚體和dNTP等的影響，該反應(yīng)只需15min且反應(yīng)液可以直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，無(wú)需純化步驟。因此，整個(gè)過(guò)程實(shí)現(xiàn)了PHD2基因快速、簡(jiǎn)單、高效地克隆至pET-43.1b(+)，成功構(gòu)建了pET-43.1b(+)-PHD2原核表達(dá)載體。

2.4.2.2 In-Fusion引物的設(shè)計(jì)? 引物的設(shè)計(jì)步驟在In-Fusion方法中非常關(guān)鍵，只要插入序列和載體兩端具有至少15bp同源序列，就可以通過(guò)In-Fusion反應(yīng)實(shí)現(xiàn)而者的無(wú)縫融合。因此，在設(shè)計(jì)In-Fusion 的PCR引物時(shí)，必須使引物末端帶有與線性化載體末端相同的同源序列，In-Fusion引物設(shè)計(jì)的基本原則是：

（1）引物的5’末端應(yīng)包含與線性化載體末端相同的15個(gè)堿基序列。

（2）引物的3’末端應(yīng)滿(mǎn)足以下條件：包含與目的基因片段相互補(bǔ)的特異堿基序列；GC含量控制在40~60%；Tm值在58~65℃之間，且正向引物與反向引物Tm值差別應(yīng)小于4℃；避免含有重復(fù)的核苷酸，最后5個(gè)核苷酸不要多于兩個(gè)G（鳥(niǎo)嘌呤）或C（胞嘧啶）。

（3）避免引物序列之間的互補(bǔ)，防止發(fā)夾結(jié)構(gòu)及引物二聚體的形成。

本研究使用在線工具http://bioinfo.clontech.com/infusion/，將pET-43.1b(+)質(zhì)粒序列、限制性?xún)?nèi)切酶SacⅠ及用于擴(kuò)增目的基因的引物序列輸入相應(yīng)位置，然后按照一系列步驟及引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)出一對(duì)特異性In-Fusion引物，很大程度上簡(jiǎn)化了引物設(shè)計(jì)步驟。

3.4.3融合標(biāo)簽對(duì)目的蛋白的影響

外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)經(jīng)常會(huì)聚集成不溶的包涵體，為后期的純化及活性研究帶來(lái)困難，而構(gòu)建融合蛋白是促進(jìn)外源蛋白可溶性表達(dá)的策略之一。大腸桿菌NusA（N-利用質(zhì)A）作為一種親水標(biāo)簽，使一些在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)不溶的蛋白在N端融合NusA后，可以在極大程度上增強(qiáng)融合蛋白的溶解性。

本研究通過(guò)pET-43.1b(+)系統(tǒng)在目的蛋白N端融合了Nus?Tag標(biāo)簽，成功地以可溶性融合蛋白的形式表達(dá)出Nus-PHD2，但融合標(biāo)簽的加入也不可避免的為目的蛋白的研究帶來(lái)一些影響：（1）NusA蛋白作為一種分子量較大的特異性促溶因子，可能會(huì)對(duì)目的蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生空間位阻，影響PHD2的活性；（2）若要切除Nus?Tag標(biāo)簽，就必須使用成本較高的特異性蛋白酶作用在專(zhuān)一的酶切位點(diǎn)上，一般酶切步驟還需要進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化；（3）融合標(biāo)簽雖然增大了目的蛋白的表達(dá)量及溶解度，但復(fù)雜的純化步驟以及標(biāo)簽的切割后純化過(guò)程會(huì)造成目的蛋白的損失，使其產(chǎn)量無(wú)法滿(mǎn)足后續(xù)研究的要求。?? 融合標(biāo)簽在外源蛋白表達(dá)和純化上的應(yīng)用是一個(gè)不斷探索的過(guò)程，相信隨著對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及包涵體形成機(jī)理等方面研究的發(fā)展，融合蛋白技術(shù)會(huì)越來(lái)越成熟，在蛋白表達(dá)領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。