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PCR-SBT方法是世界衛(wèi)生組織WHO推崇的HLA 分型的金標(biāo)準(zhǔn)，其實(shí)就是指的直接測序，無論是WGS, WES, RNA_seq 數(shù)據(jù)都可以。近幾年來涌現(xiàn)了很多的軟件，支持從NGS測序數(shù)據(jù)直接確定HLA Allel, HLAminer 就是其中之一。
官網(wǎng)如下：
https://github.com/warrenlr/HLAminer
安裝過程如下：
wget https://github.com/warrenlr/HLAminer/releases/download/v1.3.1/HLAminer-1.3.1.tar.gz
tar xzvf HLAminer-1.3.1.tar.gz
cd HLAminer-1.3.1/HLAminer_v1.3.1/下載解壓即可，軟件目錄結(jié)構(gòu)如下：
├── bin
├── database
├── database_bwamem
├── docs
└── test-demobin目錄下就是所有的可執(zhí)行腳本，database目錄下是所有的數(shù)據(jù)庫文件，包含HLA CDS序列，HLA 基因序列，不同HLA Allel共享的蛋白結(jié)構(gòu)域文件，在database目錄下還有對應(yīng)的bash腳本，可以用于更新數(shù)據(jù)庫。
該軟件的架構(gòu)如下：
HLAminer有兩種策略可供選擇：基于目的片段組裝的HPTASR和基于序列比對的HPRA。 在bin目錄下，封裝了一系列的bash腳本，可以簡化軟件的調(diào)用。
1. 基于目的片段組裝 HPTASR
基于組裝的算法精確度高，但是運(yùn)行速度是它的劣勢，對應(yīng)的bash腳本前綴為HPTASR, 包括以下4個腳本
HPTASRwgs_classI.sh
HPTASRwgs_classI-II.sh
HPTASRrnaseq_classI.sh
-
HPTASRrnaseq_classI-II.sh
wgs代表全基因組數(shù)據(jù)，rnaseq代表轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù); class I和class II分別對應(yīng)HLA I型和II 型基因，根據(jù)測序數(shù)據(jù)的類型和預(yù)測的HLA基因的類型，選擇對應(yīng)的bash腳本就可以了。
這些腳本都會讀取一個名為patient.fof的配置文件，內(nèi)容示意如下
rd1.fq
rd2.fq里面保存的是每個樣本R1端和R2端fastq文件的路徑。這些bash腳本實(shí)際是把多個步驟放在一起了，實(shí)際運(yùn)行時可以根據(jù)需要進(jìn)行修改，
HPTASRrnaseq_classI.sh內(nèi)容如下
###Run TASR
echo "Running TASR..."
#TASR Default is -k 15 for recruiting reads. You may increase k, as long as k < L/2 where L is the minimum shotgun read length
../bin/TASR -f patient.fof -m 20 -k 20 -s ../database/HLA_ABC_CDS.fasta -i 1 -b TASRhla -w 1
###Restrict 200nt+ contigs
cat TASRhla.contigs |perl -ne 'if(/size(\d+)/){if($1>=200){$flag=1;print;}else{$flag=0;}}else{print if($flag);}' > TASRhla200.contigs
###Create a [NCBI] blastable database
echo "Formatting blastable database..."
../bin/formatdb -p F -i TASRhla200.contigs
###Align HLA contigs to references
echo "Aligning TASR contigs to HLA references..."
../bin/parseXMLblast.pl -c ncbiBlastConfigO.txt -d ../database/HLA_ABC_CDS.fasta -i TASRhla200.contigs -o 0 -a 1 > tig_vs_hla-ncbi.coord
###Align HLA references to contigs
echo "Aligning HLA references to TASR contigs (go have a coffee, it may take a while)..."
../bin/parseXMLblast.pl -c ncbiBlastConfigO.txt -i ../database/HLA_ABC_CDS.fasta -d TASRhla200.contigs -o 0 > hla_vs_tig-ncbi.coord
###Predict HLA alleles
echo "Predicting HLA alleles..."
../bin/HLAminer.pl -b tig_vs_hla-ncbi.coord -r hla_vs_tig-ncbi.coord -c TASRhla200.contigs -h ../database/HLA_ABC_CDS.fasta輸出結(jié)果的文件名為HLAminer_HPTASR.csv，當(dāng)多個樣本同時運(yùn)行時，由于生成的中間文件名字相同，為了保證順利并行，必須在不同的文件夾下運(yùn)行。
2. 基于序列比對 HPRA
基于序列比對的算法，運(yùn)行速度塊，但是精確度較差，對應(yīng)的bash腳本前綴為HPRA, 包括以下腳本
HPRArnaseq_classI.sh
HPRArnaseq_classI_SE.sh
HPRArnaseq_classI-II.sh
HPRArnaseq_classI-II_SE.sh
HPRArnaseq_pacbioSEclassI.sh
HPRAwgs_classI.sh
HPRAwgs_classI_SE.sh
HPRAwgs_classI-II.sh
-
HPRAwgs_classI-II_SE.sh
腳本中不同文字的含義和HPTASR相同，以HPRArnaseq_classI.sh為例，分析步驟如下
bwa 比對：
bwa mem -a ../database_bwamem/HLA_ABC_CDS.fasta rd1.fq rd2.fq > TEST_vs_HLA.sam分型：
perl ../bin/HLAminer.pl -a TEST_vs_HLA.sam -h ../database/HLA_ABC_CDS.fasta -p ../database/hla_nom_p.txt輸出文件為HLAminer_HPRA.csv。
兩種算法雖然輸出文件的名稱不同，但是內(nèi)容是一致的，示例如下
HLA-A Prediction #1 - A*26
A*26:33,3555.00,2.66e-63,625.8
HLA-B Prediction #1 - B*55
B*55:29,2960.00,2.36e-54,536.3對于每個HLA 基因，會給出對應(yīng)的分析結(jié)果。HLAminer通常能夠給出2位或者4位的分型結(jié)果。
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