這個(gè)周末前，CJ大神終于完成了RNA-seq流程中從原始SRA數(shù)據(jù)獲取到RNA-seq定量的一系列插件。具體文章見鏈接。
http://www.itdecent.cn/p/c8b08314e133
整體上，覆蓋了數(shù)個(gè)功能，四個(gè)插件：
- SRA 數(shù)據(jù)查詢與整理：SRA XML to Table，見推文：挖掘SRA的輔助小工具（NCBI高通量測序數(shù)據(jù)收錄庫）https://mp.weixin.qq.com/s/FnuSUqhpyKqm_HYpu6phnw
- SRA 數(shù)據(jù)鏈接獲取：SRA XML to Table 和 SRA Number to ENA Info. 前者已經(jīng)包括了 NCBI 和 DDBJ 數(shù)據(jù)下載鏈接，后者主要作為補(bǔ)充，附加 ENA 下載鏈接（更為穩(wěn)點(diǎn)）。詳細(xì)見：公開可獲取~沒有下載不到的測序原始數(shù)據(jù)！https://mp.weixin.qq.com/s/CS04e0QRjq0B-NZUfCpUAg
- Ascp GUI Wrapper：個(gè)人實(shí)測，每天清晨通過 FTP 鏈接下載測序原始數(shù)據(jù)，速度可以達(dá)到 10Mb/s。但更多時(shí)候數(shù)據(jù)只有不到 300Kb/s。網(wǎng)絡(luò)合適的情況下，可以使用 Aspera ，速度可以達(dá)到 30Mb/s。于是寫了并公開釋放了這個(gè)插件，詳細(xì)見：插件 | 人人-點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)-光速下載 NCBI/ENA NGS原始數(shù)據(jù) https://mp.weixin.qq.com/s/YYneVPb3V6Dq5WXiq2JYTQ
- SRAtoFastq，sra 是 NCBI 定義的二代數(shù)據(jù)存儲格式，文件大小比fastq.gz下，考慮網(wǎng)絡(luò)帶寬的情況下，下載 sra 數(shù)據(jù)更方便。下載后需要進(jìn)行轉(zhuǎn)換，于是有了插件，詳細(xì)見：SRAtoFastq | 任何人都能自主分析測序原始數(shù)據(jù) https://mp.weixin.qq.com/s/WC6Q1wr2M4CsdVZ2XYFjRA
- FastQC，無論是NCBI SRA等數(shù)據(jù)庫下載，還是公司返還的測序數(shù)據(jù)，多少還是要看下測序質(zhì)量，確保質(zhì)量OK 或者不要有樣品降解，嚴(yán)重污染云云，于是有插件，詳細(xì)見：插件FastQC | 點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)，人人看看測序數(shù)據(jù)質(zhì)量 https://mp.weixin.qq.com/s/Sz9enr_8s9P0goxEObn4TA
- Trimmomatic，無論轉(zhuǎn)換得到，或者是公司測序后返還的 Fastq.gz 數(shù)據(jù)往往是原始數(shù)據(jù)，通過 FastQC 可以判斷，隨后進(jìn)行質(zhì)量控制，如去除接頭和低質(zhì)量堿基，于是有插件，詳細(xì)見：Trimmomatic | 點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)，測序原始數(shù)據(jù)質(zhì)控，技能√get https://mp.weixin.qq.com/s/Gmazcogi2KBNkv7J4hXh9Q
- Kallisto，RNAseq 數(shù)據(jù)的基本分析和目的，就是獲得基因表達(dá)量矩陣。在普通筆記本上，如 4G 內(nèi)存云云，那么 Kallisto 是最好的選擇，于是有插件，詳細(xì)見：
Kallisto | 點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn)，從 測序數(shù)據(jù) 到 基因表達(dá)量矩陣 人人都可以！ https://mp.weixin.qq.com/s/zhYjsF-LiPzPetbVh7bfcA- Trans Value Sum，Kallisto 分析結(jié)果是轉(zhuǎn)錄本水平的表達(dá)量或Counts矩陣，但很多人感興趣的是基因水平的，于是，公開釋放了功能，詳細(xì)見：匯總 | 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)矩陣 到 基因表達(dá)矩陣 https://mp.weixin.qq.com/s/JPM7ofuqZcKPZjySL7w5lA
首先感謝CJ大神能夠花時(shí)間在RNA-seq插件的開（da）發(fā)（bao）工作上（再也不能push作者了）。雖然他本人經(jīng)常自嘲只是在wrap，但這一系列插件足夠消除seq新手入門的門檻。我相信新手只要順著這個(gè)匯總操作，不需要命令行，每個(gè)人都能完成seq的RNA定量表達(dá)分析（只要你肯）。當(dāng)然從bioinformation研究的角度上來看，這些插件效率不夠高，也沒辦法進(jìn)行大規(guī)模seq定量（>10），更無法自由定制化。但是對于那些只是做初步挖掘獲取線索的科研人員（例如用新方法挖掘已經(jīng)存在的seq數(shù)據(jù)），或者是只想做6-10個(gè)樣本的小型課題組來說（需要一套seq數(shù)據(jù)來講故事的時(shí)候），這套插件的幫助是非常巨大的（這也是作者的本意）。
接下來我會根據(jù)CJ大神給出的步驟，分別給出TBtools和命令行的實(shí)現(xiàn)方式從數(shù)據(jù)查詢、下載、轉(zhuǎn)換、質(zhì)檢、修剪、定量、表達(dá)矩陣的全套流程。希望每個(gè)堅(jiān)持下來的人能走出自閉，順利完成seq數(shù)據(jù)的定量分析。
數(shù)據(jù)獲取
首先我們需要找到一個(gè)數(shù)據(jù)集下載（如：PRJNA358808 或者 SRP095684）。通常我們可以去NCBI或者ENA去搜索關(guān)鍵字查找到相應(yīng)信息。下面分別介紹這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫獲取ftp下載地址的方式。
NCBI
NCBI查詢地址如下：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=prjna358808
看到一共有24個(gè)runs，點(diǎn)擊右上角的”send to“
這里選擇保存為文件，格式選擇完整的XML文件，最后點(diǎn)擊create file下載.
在TBtools打開SRA XML to Table tab，分別按照要求填好xml文件和輸出路徑，之后點(diǎn)擊確定。
可以看到所有下載地址已經(jīng)被匯總在一個(gè)表格里了。
需要注意的是，由于TBtools默認(rèn)保存的格式是txt，這里會提示你格式不匹配，選擇是直接打開就好了，excel會自動識別文件的。
ENA下載地址獲取方式
同樣是在ENA查詢，地址如下：
https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/text-search?query=PRJNA358808
這里選擇run可以看到所有SRR列表
復(fù)制到excel里，默認(rèn)會分成2行
這里還是按照填入對應(yīng)的信息即可，如圖：
點(diǎn)擊開始，該插件會把你輸入的所有SRRnum的下載信息全部匯總在一個(gè)叫SRR_download_info_table的excel文件中。
這樣，你就獲得了所有SRR的下載地址，值得注意的是，這個(gè)表格數(shù)據(jù)很奇怪。命名是雙端測序的數(shù)據(jù)，但fastq居然只有一個(gè)文件。
正常的雙端測序應(yīng)該有兩個(gè)文件的
保險(xiǎn)起見我們還是下載所有SRA文件，再用插件把SRA轉(zhuǎn)為Fastq吧。
另外，ENA好像沒有整個(gè)實(shí)驗(yàn)的描述，我們還是得去NCBI查看整個(gè)實(shí)驗(yàn)的method和sample。地址如下“
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=SRP095684&o=acc_s%3Aa
最后，這些步驟似乎都沒用到命令行……好像也沒有必要
