Smart-seq： Smart-seq2的前身是Smart-seq，它是首個用于單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的方法。Smart-seq的提出可以追溯到2012年，它的原理是通過在反轉(zhuǎn)錄過程中引入一個定制引物，將細胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄本進行全長合成。這使得可以獲得單細胞水平上更詳細和全面的基因表達數(shù)據(jù)。

Smart-seq2的改進： 隨著技術(shù)的發(fā)展，Smart-seq2在Smart-seq的基礎(chǔ)上進行了改進，以提高單細胞RNA測序的效率和覆蓋度。Smart-seq2的引物設(shè)計更加精確，可以更好地應(yīng)對低質(zhì)量RNA樣本，并且在捕獲基因表達信息時表現(xiàn)更為靈敏。

技術(shù)特點：

1.全長轉(zhuǎn)錄本測序： Smart-seq2使用全長轉(zhuǎn)錄本測序的方法，使得可以獲取細胞中每個基因的完整轉(zhuǎn)錄本信息，而不是只關(guān)注特定區(qū)域。這有助于更準確地了解單細胞的基因表達譜。

2.高靈敏度： 引物設(shè)計的改進和全長轉(zhuǎn)錄本測序的特點使得Smart-seq2在捕獲低表達基因和檢測單個細胞中稀有轉(zhuǎn)錄本方面更為靈敏。

3.適用性廣泛： Smart-seq2的技術(shù)特點使其適用于各種細胞類型和樣本來源，包括低質(zhì)量的單細胞RNA。

4.單細胞分辨率： Smart-seq2具有較高的單細胞分辨率，可以在單細胞水平上深入挖掘細胞異質(zhì)性和亞型。

5.低輸入RNA樣本： 與一些其他單細胞RNA測序方法相比，Smart-seq2對RNA輸入量的要求較低，這使得可以應(yīng)用于限制性的細胞樣本。

分析流程：

和10x Gemonics不同，Smart-seq2在建庫過程中，對每個孔中添加的index序列是已知的，所以整體分析思路是首先根據(jù)每個孔板中的index拆分fastq，然后進行比較、定量、基因表達技術(shù)。流程基本和bulk RNA-seq分析流程相似。最后將每個孔板中基因表達水平合并為所有細胞的表達。主要包括以下步驟：

1.質(zhì)控

使用fastqc軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，fastqc的使用見教程，（待補充）

2.拆分

sabre是一款根據(jù)barcode(index)進行拆分的軟件，在github上下載之后（如果無法下載，請右側(cè)掃碼聯(lián)系博主），執(zhí)行下述命令

$ cd /path/to/sabre
$ make

執(zhí)行完成之后，用ls查看當前目錄，新生成的sabre即可使用

$ ls -l .
$ ll
total 67
-rw-r--r-- 1 *** group  1023 Feb  3  2021 LICENSE
-rw-r--r-- 1 *** group   924 Feb  3  2021 Makefile
-rw-r--r-- 1 *** group  4160 Feb  3  2021 README.md
-rw-r--r-- 1 *** group  1312 Feb  3  2021 barcode.o
-rw-r--r-- 1 *** group 16392 Feb  3  2021 demulti_paired.o
-rw-r--r-- 1 *** group 12104 Feb  3  2021 demulti_single.o
-rwxr-xr-x 1 *** group 27183 Feb  3  2021 sabre             #可執(zhí)行文件
-rw-r--r-- 1 *** group  3424 Feb  3  2021 sabre.o
drwxr-xr-x 2 *** group  4096 Feb  3  2021 src

sabre可用于拆分單端和雙端測序數(shù)據(jù)，具體用法如下：

$ sabre 

Usage: sabre <command> [options]

Command:
pe  paired-end barcode de-multiplexing
se  single-end barcode de-multiplexing

--help, display this help and exit
--version, output version information and exit

我們這里都雙端測序結(jié)果進行拆分，使用方法如下：

$ sabre pe \
           -r R1.fq.gz \                #R1
           -f R2.fq.gz \                #R2
           -b barcode.txt \             #barcode: barcode_seq   file1_out   file2_out
           -m 2 \
           -u unknown_sepID.fastq \
           -w unknown_UMI.fastq