現(xiàn)在做轉(zhuǎn)錄組測序，看看差異基因，做做富集分析，再討論下差異基因功能與自己研究性狀或處理之間的關(guān)系，最后加簡單的qPCR驗證，這樣的數(shù)據(jù)發(fā)SCI影響因子越來越低了。必須增加新的分析內(nèi)容才能有所突破。今天給大家介紹一個能給文章增色的分析內(nèi)容--基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），該分析對樣品數(shù)有一定要求，建議不少于15個，不過現(xiàn)在測序便宜了，達到這個數(shù)量已經(jīng)不是難事了。下面就給大家介紹兩篇利用WGCNA分析基因共表達網(wǎng)絡(luò)來提升文章檔次。
文章1：
題目：
Identification of regulatory networks and hub genes controlling soybean seed set and size using RNA sequencing analysis
期刊：Journal of Experimental Botany
IF：5.3
性狀：大豆籽粒大小
實驗材料
大豆籽粒的大小是一個非常重要的農(nóng)藝性狀，直接關(guān)系到大豆產(chǎn)量，找到?jīng)Q定大豆籽粒大小的關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)罄m(xù)的分子育種具有重要意義，因此作者，選取了兩個大豆品種做轉(zhuǎn)錄組分析，分別是：大籽粒Wandou 28 (V1)，小籽粒Peixian Layanghuang (V2)，取樣時期為三個時期：seed set (S1), seed growth (S2), and early seed maturation (S3)，其中前兩個時期的取樣部位分別為：Seed pod with whole seed（S1），Whole seed（S2），S3時期取了兩個部位分別為：Seed coat（S3-1），Seed cotyledon（S3-2），兩個品種每個樣品三個生物學重復共24個樣品。下圖為種子發(fā)育不同時期照片以及籽粒大小差異統(tǒng)計結(jié)果：
轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果：
對轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果中每個基因做表達量分析，計算每個基因的表達量FPKM，如果基因的表達量，也就是FPKM值<0.5，認為基因無表達，去除這部分基因。然后，統(tǒng)計每個時期不同品種基因表達量高低的分布圖，大約一半的基因處于低表達水平0.5<=FPKM<=5（下圖A）；pca分析發(fā)現(xiàn)樣品按照不同發(fā)育時期聚類在一起，而不是按照不同品種聚類，說明發(fā)育時期是決定基因表達譜的關(guān)鍵因素，而性狀的不同引起的轉(zhuǎn)錄表達差異較?。ㄏ聢DB），下圖C展示的為不同品種，不同發(fā)育時期之間表達基因的韋恩圖，在不同的發(fā)育時期都表達的基因還是占絕大多數(shù)：
差異基因分析：
差異基因分析，下圖A按相同發(fā)育時期，不同的品種之間差異比較，下圖B為不同發(fā)育時期之間的差異比較，紅色數(shù)字代表上調(diào)差異基因數(shù)量，黑色代表下調(diào)的差異基因數(shù)量：
差異基因功能注釋分析，主要針對決定籽粒大小的差異基因的比較，也就是上圖A中的差異基因進行功能分析，挑出一些代表基因，看一下他的功能和表達量，例如，V1S1 ?vs V2S1差異比較當中，共找到973個差異基因，其中489個基因上調(diào)，484個基因下調(diào)，上調(diào)的代表基因的功能及表達量表格如下圖所示，其中有轉(zhuǎn)錄因子，植物荷爾蒙（生長素等），脂肪酸代謝，蛋白激酶活性，類黃酮生物合成等功能相關(guān)的基因，總之挑選與種子果實等發(fā)育生長相關(guān)的基因來展示，其他還有好幾個表格，也是關(guān)于上圖A中不同時期的上調(diào)下調(diào)基因的功能注釋表格，展示類似，我這里就不詳細說明了，感興趣的可以查看原文：
不同發(fā)育時期差異比較：
不同的發(fā)育時期差異基因比較，分別繪制每個發(fā)育時期高表達的基因的熱圖，差異基因很多，作者挑選的都是和發(fā)育相關(guān)，或者和重要農(nóng)藝性狀相關(guān)的差異基因做熱圖，例如轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的基因，荷爾蒙相關(guān)的，脂肪酸代謝，淀粉糖代謝等相關(guān)的基因。
WGCNA分析找到調(diào)控籽粒大小的關(guān)鍵hub基因：
首先對所有樣品所有基因的表達量矩陣進行過濾，刪除表達量低的基因（FPKM<0.05），一共有7359個基因用于基因共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，總共分析得到12個共表達基因模塊下圖A（聚類樹每一個枝代表一個基因，下面不同的顏色劃分代表基因所處不同的模塊），其中有4個模塊和種子大小相關(guān)下圖B，例如，lightyellow模塊，所有的V1的不同時期的樣品與這個模塊高度相關(guān)，再例如green模塊，有793個基因，不管是V1樣品，還是V2樣品，這個模塊都與S1相關(guān)等等。
4個關(guān)鍵模塊基因共表達網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)hub基因：
導出WGCNA共表達網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，繪制模塊當中基因的表達量熱圖和網(wǎng)絡(luò)圖，左邊熱圖從上到下分別代表：green module（A），darkturquoise module（C），black module（E），lightyellow module（G），右邊網(wǎng)絡(luò)圖分別對應共表達網(wǎng)絡(luò)，其中紅顏色標記的為連通性較高的hub基因。通過研究這些hub基因的功能發(fā)現(xiàn)：這些網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵hub基因，包括MYB家族轉(zhuǎn)錄因子，荷爾蒙（ABA，CK，BA）響應因子，細胞色素P450，BR信號激酶等等，都可能與籽粒的大小相關(guān)。
文章2：
題目：
Global transcriptome and co-expression network analyses reveal cultivar-specific molecular signatures associated with seed development and seed size/weight determination in chickpea analysis
期刊：The Plant Journal
IF：5.7
性狀：鷹嘴豆籽粒大小
實驗材料與方法
這篇文章與上一篇文章思路幾乎一致，只是研究的物種變成了鷹嘴豆。同樣的，也是選取了兩個籽粒大小差異明顯的栽培品種：Himchana 1 (small-seeded) and JGK 3 (large-seeded)，取樣時期為每個樣品7個時期S1-S7，分別為授粉后5, 9, 12, 19, 25, 30 and 40 天（day after pollination DAP），還測了一下葉片的轉(zhuǎn)錄組，并取3個生物學重復，共48個樣品。不同發(fā)育時期和種子重量差異結(jié)果如下：
轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果：
利用轉(zhuǎn)錄組測序所有基因以及所有樣品的表達矩陣做樣品間的相關(guān)性分析和PCA聚類分析，從中可以發(fā)現(xiàn)，相同的發(fā)育狀態(tài)或者組織聚類在一起，說明他們之間具有較強的相關(guān)性。
差異基因比較分析：
作者主要比較了相同發(fā)育狀態(tài)不同品種之間的轉(zhuǎn)錄組差異比較，差異基因的上下調(diào)數(shù)量和其中轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量圖a，另外還統(tǒng)計差異基因中不同類型轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量展示圖b，圖c為不同時期差異基因的富集結(jié)果，顏色越深說明在該功能上越富集，最后S3時期差異基因在mapman中的Metabolic pathways做了富集分析，可以將差異基因的表達量變化情況展示在通路圖中。
基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析
首先作者將不同的樣品按籽粒大小不同品種分開，分別用WGCNA做共表達網(wǎng)絡(luò)分析，其中在Himchana 1樣品中共找到27個模塊(a)，在JGK 3樣品中找到21個模塊(b)如下圖所示：
模塊與樣品之間相關(guān)性分析，從而發(fā)現(xiàn)不同發(fā)育時期的特有的基因模塊，這部分也是分開做，圖中顏色越紅的方框?qū)哪K和樣品具有較高的相關(guān)性，左邊一半為Himchana 1中模塊與發(fā)育時期相關(guān)圖，右邊一半為JGK3模塊與發(fā)育時期相關(guān)結(jié)果，然后得到每個樣品中每個時期對應的最相關(guān)的模塊,(如下圖)：
結(jié)合上一步的分析結(jié)果，再來分析兩個品種各自得到的模塊之間的相關(guān)性，理論上講，雖然品種不同但是各自品種相同發(fā)育時期的對應的特有模塊應該具有較高的相關(guān)性，例如，在JGK 3樣品中左下角黑色模塊與S6發(fā)育時期相關(guān)，通過相關(guān)性分析，這個模塊與Himchana 1中的darkorange相關(guān)，正好呢darkorange模塊在Himchana 1 中也與S6相關(guān)（下圖中紅紫色方框）；同樣的道理其他很多模塊都有這樣的相關(guān)性（下圖中紅色方框），但是在Himchana 1 中有個orange模塊不與JGK 3中任何一個模塊相關(guān)，作者推斷這個特殊的模塊很可能與籽粒大小相關(guān)，當然還有其他幾個模塊也有類似的現(xiàn)象。作者進一步研究這些模塊中基因表達情況發(fā)現(xiàn)里面很多基因的表達量（在S3 和 S5時期）在不同的品種中具有相反的表達，之后作者進一步研究這些模塊里面基因的相關(guān)功能等等：
總結(jié)：
上述兩篇文章都是植物當中普通的轉(zhuǎn)錄組文章，由于添加了WGCNA分析從另一個角度分析與性狀相關(guān)的基因，文章的檔次提升不少。想得到WGCNA的分析技能嗎，點擊《WGCNA視頻教學視頻》即可觀看：手把手教學包你學會。
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