前沿
表觀遺傳學(xué)，包括組蛋白共價(jià)修飾(covalent histone modification)、DNA甲基化修飾(DNA methylation)、RNA甲基化修飾(RNA methylation)、基因組印記(genomic imprinting)、基因沉默(gene silencing)、RNA編輯(RNA editing)及非編碼RNA(noncoding RNA)等，是指在核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，生物表型或基因表達(dá)發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳變化。
RNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，是指發(fā)生在RNA分子上不同位置的甲基化修飾現(xiàn)象，6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)和5-甲基胞嘧啶(C5-methylcytidine，m5C)是真核生物中最常見的兩種RNA轉(zhuǎn)錄后修飾。RNA甲基化在調(diào)控基因表達(dá)、剪接、RNA編輯、RNA穩(wěn)定性、控制mRNA壽命和降解等方面可能扮演重要角色。 相對(duì)于DNA甲基化，RNA甲基化更加復(fù)雜、種類繁多、普遍存在于各種高級(jí)生物中。
已知絕大部分真核生物中，mRNA在5’ Cap處存在甲基化修飾，作用包括維持mRNA穩(wěn)定性、 mRNA前體剪切、多腺苷酸化、 mRNA運(yùn)輸與翻譯起始等。而3’ polyA發(fā)生的修飾有助于出核轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯起始以及與polyA結(jié)合蛋白?起維持mRNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。但是這些修飾只發(fā)生mRNA的頭部和尾部，關(guān)于RNA的內(nèi)部修飾（internal modification）在許多種類的RNA中都有發(fā)?。無(wú)論是mRNA還是lncRNA，都大量存在m6A修飾。m6A能夠加速mRNA前體的加工時(shí)間，加快mRNA在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)速度和出核速度。主要學(xué)習(xí)研究較多的m6A。RNA的m6A甲基化?共有大三類酶參與：Writers、 Erasers和Readers，需要相關(guān)研究的可以學(xué)習(xí)相關(guān)文獻(xiàn)。
如何檢測(cè)m6A
檢測(cè)m6A的方法非常多，如包括MeRIPseq、 miCLIP-seq、 SCARLET、 LC-MS/MS等。2012年之后，兩篇發(fā)表于Nature和Cell上的論?可以說(shuō)是第?次從轉(zhuǎn)錄水平上，大范圍高通量地鑒定了人和小鼠m6A的甲基化水平（Dominissini 2012和Meyer 2012）。這兩篇獨(dú)立發(fā)表的論文采用的核心方法就是將m6A抗體與帶有m6A的mRNA片段相結(jié)合后進(jìn)行高通量測(cè)序。通過(guò)對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)的分析，來(lái)鑒定mRNA上m6A程度較高的區(qū)域，分辨率約為100nt。這種方法我們稱之為MeRIP-seq（methylated RNA immunoprecipitation sequencing）或m6A-seq。
MeRIP-seq建庫(kù)步驟：
1. 提取total RNAs，并用Oligo-dT磁珠對(duì)total RNAs帶有polyA的mRNA進(jìn)行富集（通常要求Total RNA 300ug，人鼠可以做微量2ug 但結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)map率低dup率高 建庫(kù)步驟與常量也有區(qū)別）；
2. 用磁珠進(jìn)行富集，得到帶有polyA的mRNA。之后加入片段化試劑，將完整的mRNA進(jìn)行片段化。或者使用超聲波儀直接進(jìn)行片段化；
3. 將片段化后的RNA分成兩份。?份加入帶有m6A抗體的免疫磁珠，對(duì)含有m6A甲基化的mRNA片段進(jìn)?富集。另?份作為control，直接構(gòu)建類似常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)（這一步就是IP步驟，片段化程度、抗體抓取效率都會(huì)影響到后期實(shí)驗(yàn)結(jié)果；這里的control通常稱為Input）；
4. 對(duì)m6A抗體免疫磁珠進(jìn)行富集，帶有m6A的mRNA片段進(jìn)行回收后，按照轉(zhuǎn)錄組的建庫(kù)流程構(gòu)建常規(guī)的測(cè)序文庫(kù)；
5. 分別將構(gòu)建好的2個(gè)測(cè)序文庫(kù)，即m6A-seq library和RNA-seq library分別進(jìn)行高通量測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)保持一致，推薦Hiseq X ten或Novaseq；
6. 對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，對(duì)發(fā)生m6A甲基化程度較高的區(qū)域進(jìn)行peak calling。由于不能做到單個(gè)堿基的分辨率，所以只能對(duì)大致的區(qū)域進(jìn)行分析。從下圖中我們可以發(fā)現(xiàn)，與右側(cè)常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果相比，在基因上有兩處區(qū)域存在非常明顯的高甲基化峰；
7.接下來(lái)會(huì)進(jìn)行一些常規(guī)分析，如peak區(qū)域基因注釋，差異peak分析。
以上就是關(guān)于m6A-seq的標(biāo)準(zhǔn)步驟，現(xiàn)在是不是對(duì)m6A-seq有了一個(gè)非常直觀的認(rèn)識(shí)呢？ 再次強(qiáng)調(diào)下，這種測(cè)序方法只能鑒定高甲基化的區(qū)域，并不能做到單堿基的分辨率。
m6A研究思路
思路1 老數(shù)據(jù)挖掘
第一步：先從原有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，挖掘到差異表達(dá)的甲基化酶；
第二步：對(duì)挖掘到的甲基化酶如METTL3或FTO等進(jìn)?qPCR驗(yàn)證，并進(jìn)行m6A-seq分析哪些基因甲基化水平發(fā)生改變；
第三步：在細(xì)胞（動(dòng)物模型可選）中對(duì)這些酶進(jìn)行敲低和過(guò)表達(dá)，進(jìn)行常規(guī)的qPCR和WB檢測(cè)相關(guān)酶表達(dá)情況，并用LC-MS/MS法檢測(cè)RNA整體m6A水平；
第四步：繼續(xù)對(duì)這些敲低和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序/小RNA測(cè)序或表達(dá)譜芯片/小RNA芯片，分析哪些基因出現(xiàn)差異表達(dá)變化和可變剪切變化；
第五步：找到甲基化酶調(diào)控的靶基因，進(jìn)行敲低和過(guò)表達(dá)，看甲基化酶缺陷的細(xì)胞或動(dòng)物模型表型能否補(bǔ)救；
第六步：在確定上一步靶基因確實(shí)受到甲基化酶調(diào)控后，對(duì)靶基因上的motif進(jìn)行點(diǎn)突變后進(jìn)行驗(yàn)證；
第七步：鑒定新型的甲基化酶（可選）。
思路2 研究甲基化修飾差異基因
第一步：直接進(jìn)行m6A-seq和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，找到時(shí)間順序或差異表達(dá)的基因并用qPCR、 WB等?法驗(yàn)證，此外找到m6A有差異的基因；
第二步：對(duì)甲基化酶進(jìn)行敲低和過(guò)表達(dá)，檢測(cè)RNA整體的m6A水平，之后可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組或小RNA測(cè)序等方法檢驗(yàn)甲基化酶敲低和過(guò)表達(dá)對(duì)mRNA或miRNA整體的影響，并著重研究第?步中感興趣的m6A有差異的靶基因；
第三步：對(duì)靶基因進(jìn)行敲低或過(guò)表達(dá)，是否能夠?qū)谆府惓１磉_(dá)后的表型進(jìn)?恢復(fù)；
第四步：對(duì)靶基因上motif進(jìn)行點(diǎn)突變后進(jìn)?步確認(rèn)直接受到甲基化酶調(diào)控；
第五步：鑒定新型的甲基化酶（可選）。
當(dāng)然根據(jù)不同的研究目的還有許多其他的研究思路，可根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行延申和拓展。m6A相關(guān)SCI論文根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)手段IF2~20不等，實(shí)驗(yàn)手段：m6A-seq、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序/表達(dá)譜芯片、 LC-MS/MS 或 m6A 比色法、小RNA 測(cè)序/小RNA芯片、qPCR、 WB、敲降/過(guò)表達(dá)、靶基因驗(yàn)證、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床實(shí)驗(yàn)/藥物實(shí)驗(yàn)等。
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參考學(xué)習(xí)：
1、高通量RNA甲基化測(cè)序數(shù)據(jù)處理與分析研究進(jìn)展
Roundtree, Ian A et al. “Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation.” Cell vol. 169,7 (2017): 1187-1200. doi:10.1016/j.cell.2017.05.045
Helm, M, & Y. Motorin. "Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate.” Nature Reviews Genetics 18.5 (2017):275.
