影響因子：5.8
研究概述：
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白復(fù)合物亞基6（EMC6），也稱為跨膜蛋白93 (TMEM93)，在細(xì)胞的生理和病理狀態(tài)中都起著重要作用。本研究全面分析了EMC6在33種癌癥中的功能機(jī)制，進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析，包括差異表達(dá)分析、腫瘤突變負(fù)荷分析、預(yù)后分析和臨床病理分期分析。然后通過細(xì)胞學(xué)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了EMC6在肺癌中的作用：EMC6調(diào)節(jié)肺腺癌中免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)以及調(diào)節(jié)肺腺癌中鐵死亡和銅死亡的發(fā)生。
流程圖：
研究結(jié)果：
一、EMC6在多種癌癥中的高表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)
1. 基于TIMER數(shù)據(jù)庫中33種癌癥中EMC6的表達(dá)，作者發(fā)現(xiàn)，除腎嗜色細(xì)胞癌（KICH）和腎透明細(xì)胞癌（KIRC）中的表達(dá)水平顯著降低外，EMC6在大多數(shù)癌癥中的表達(dá)極高于相應(yīng)的正常組織（圖1A），在膀胱尿路上皮癌 （BLCA）、乳腺浸潤(rùn)癌（BRCA）、食管癌 （ESCA） 和 肺腺癌（LUAD）中尤為明顯。
2. TMB值顯示了腫瘤細(xì)胞中基因突變的情況，這些具有更多基因突變的腫瘤細(xì)胞更能夠刺激免疫反應(yīng)。因此TMB值也能在一定程度上反映患者的預(yù)后。
33種癌癥的TMB分析結(jié)果顯示，EMC6的表達(dá)與胃腺癌（STAD）、肉瘤（SARC）、子宮體子宮內(nèi)膜癌（UCEC）和LUAD的基因突變密切相關(guān)（圖1B）。
3. 基因表達(dá)變異對(duì)患者預(yù)后的影響是衡量該基因是否為此類癌癥重要生物標(biāo)志物的關(guān)鍵標(biāo)準(zhǔn)。
單因素Cox回歸分析森林圖顯示，EMC6表達(dá)改變對(duì)宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸內(nèi)膜腺癌（CESC）、ESCA、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）等7種癌癥的患者預(yù)后有顯著影響（圖1C）。其中，EMC6的表達(dá)對(duì)LUAD患者的預(yù)后影響最為顯著（p < 0.001）。
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在總生存期 OS分析中，與腎上腺皮質(zhì)癌 ACC、CESC、LGG、LUAD、肺鱗癌 LUSC和胰腺癌PAAD相比，EMC6高表達(dá)患者與EMC6低表達(dá)患者相比預(yù)后差（圖1D）。
二、EMC6 參與許多癌癥的惡性進(jìn)展
1. 疾病特異性生存期DSS在33種癌癥中的單因素Cox回歸分析表明，EMC6的表達(dá)與多種癌癥中的DSS密切相關(guān)，如BLCA（p=0.032）、CESC（p=0.01）、LGG（p=0.018）、PAAD（p=0.04）等（圖2A）。正如預(yù)期，EMC6的表達(dá)對(duì)LUAD的DSS的影響仍然最強(qiáng)（p = 0.004）。
2. Kaplan-Meier（KM）分析結(jié)果顯示，有6種癌癥的DSS與EMC6的表達(dá)密切相關(guān)（圖2B）。其中就包括LUAD（p = 0.023）。
3. 患者的臨床分期反映了患者的臨床病理特征，即腫瘤組織的惡性進(jìn)展和患者的預(yù)后。因此，作者在GEPIA2數(shù)據(jù)庫中檢索了EMC6在33種癌癥中不同病理階段的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在KICH、LUAD和皮膚黑色素瘤 SKCM中，EMC6 的表達(dá)隨著腫瘤的進(jìn)展而逐漸增加；相反，在腎乳頭狀細(xì)胞癌KIRP和子宮癌肉瘤UCS中，EMC6的表達(dá)隨著腫瘤的進(jìn)展而逐漸降低（圖2C）。
4. 此外，作者使用了以下兩圖以更好地驗(yàn)證結(jié)果。
圖3：來自HPA數(shù)據(jù)庫的生存分析數(shù)據(jù)
圖4：EMC6與DNA甲基化之間的關(guān)系
三、EMC6表達(dá)與腫瘤免疫的關(guān)系
1. 為探究EMC6是否參與33種癌癥的腫瘤免疫，作者對(duì)TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行了EMC6與一系列免疫相關(guān)基因的共表達(dá)分析。熱圖表明，除了ACC、淋巴樣腫瘤彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBC)、間皮瘤(MESO)和UCS外，在幾乎所有類型的癌癥中，EMC6的表達(dá)與免疫激活基因（圖5 A）、趨化因子（圖5 B）、趨化因子受體（圖5 C）和主要組織相容性復(fù)合物（MHC）（圖5D）密切相關(guān)。
2. 此外還發(fā)現(xiàn) EMC6 的表達(dá)與 KICH 和葡萄膜黑色素瘤 UVM等癌癥的免疫反應(yīng)顯著正相關(guān)，與膽管癌 CHOL 和 LUAD 等癌癥的免疫反應(yīng)顯著負(fù)相關(guān)（圖 5）。
四、EMC6 在 LUAD 中的關(guān)鍵作用
1. 通過前期分析，作者發(fā)現(xiàn)EMC6參與多種癌癥，特別是LUAD的腫瘤免疫應(yīng)答。EMC6的表達(dá)與各種免疫相關(guān)基因呈顯著負(fù)相關(guān)，表明EMC6很可能參與LUAD的免疫逃逸過程。因此首先使用來自多個(gè)GEO數(shù)據(jù)集（GSE19188、GSE44077、GSE31201和jacob-00182-HLM）的差異表達(dá)分析（圖6A、B）和生存分析（圖6 C、D），來確認(rèn)EMC6在LUAD中的關(guān)鍵作用。然后在LUAD中構(gòu)建了EMC6的microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖6 E），并在CCLE數(shù)據(jù)庫中觀察EMC6在各種LUAD細(xì)胞系中的表達(dá)（圖6F）。
2. 接下來通過CIBERSORT算法重新評(píng)估了EMC6與LUAD腫瘤免疫的關(guān)系。結(jié)果表明，EMC6 與 LUAD 中的肥大細(xì)胞、CD4 T 細(xì)胞、免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)（圖 7A）。為驗(yàn)證分析，作者使用 siRNA 構(gòu)建了 EMC6 敲低 LUAD 細(xì)胞系 A549，并使用 qPCR 驗(yàn)證了 EMC6 敲低的效率（圖 7B）。
3. 然后作者使用構(gòu)建的 EMC6 敲低 A549 細(xì)胞系進(jìn)行了一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。
首先，CCK-8 測(cè)定結(jié)果顯示 EMC6 蛋白水平的降低大大降低了A549的增殖能力（圖 7C）。
其次，transwell測(cè)定結(jié)果顯示，與正常A549細(xì)胞相比， EMC6敲低的A549細(xì)胞在同一時(shí)間內(nèi)遷移和侵襲的數(shù)量明顯減少(圖7D)。
最后，傷口愈合試驗(yàn)的結(jié)果再次證明，EMC6的存在對(duì)A549的遷移能力起著至關(guān)重要的作用（圖7E）。
- 作者想探索EMC6在LUAD中的機(jī)制。在前人研究中，EMC6已被證明是自噬的關(guān)鍵基因，故作者推測(cè)EMC6也參與了LUAD中的鐵死亡和銅死亡過程。而共表達(dá)分析表明，EMC6確實(shí)與這些與鐵死亡和銅死亡相關(guān)的基因密切相關(guān)（圖7F）。為使這一發(fā)現(xiàn)更具臨床應(yīng)用性，作者使用連通性圖譜（CMap）來預(yù)測(cè)EMC6相關(guān)的小分子化合物及其相應(yīng)的靶基因，發(fā)現(xiàn)“米托坦”很可能能夠調(diào)節(jié)肺癌和糖尿病之間的關(guān)聯(lián)。
5. 作者對(duì)LUAD中EMC6相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析（圖7G）：主要富集的KEGG通路是 JAK-STAT 信號(hào)通路、細(xì)胞粘附分子（CAMs）、絲裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信號(hào)通路和核糖體；主要富集的分子功能MF是核糖體和細(xì)胞因子受體活性的結(jié)構(gòu)成分；EMC6的生物過程BP是前體代謝物和能量的產(chǎn)生以及GTP酶活性的調(diào)節(jié)；細(xì)胞成分CC是線粒體內(nèi)膜和線粒體基質(zhì)和受體復(fù)合物。
此外，TIMER數(shù)據(jù)庫的結(jié)果表明，EMC6的表達(dá)水平對(duì)LUAD中多種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)有顯著影響（圖7H）。
6. 緊接著進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以更好地觀察真實(shí)過程。作者構(gòu)建了C57小鼠皮下激素腫瘤模型（圖 8A），可見降低LUAD細(xì)胞中EMC6的表達(dá)可顯著降低腫瘤的生長(zhǎng)速度（圖8 B），并顯著增加腫瘤組織中免疫細(xì)胞（CD4 T細(xì)胞，CD8 T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的浸潤(rùn)（圖8C、D）。
7. 為提高本研究的臨床意義，作者從HPA數(shù)據(jù)庫中觀察了EMC6在LUAD組織和正常肺組織中的免疫組化結(jié)果。結(jié)果顯示，LUAD組織中EMC6的表達(dá)顯著高于正常肺組織中的表達(dá)（圖9）。
研究總結(jié)：
EMC6 是一種重要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，近年來已被鑒定為參與自噬，然而作者發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)研究關(guān)注EMC6在癌癥中的調(diào)節(jié)作用。本研究是首個(gè)對(duì)腫瘤中EMC6進(jìn)行泛癌變分析的研究，并驗(yàn)證和推測(cè)了其在LUAD中鐵死亡、銅死亡和免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。這些發(fā)現(xiàn)將為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白在腫瘤治療中的調(diào)控作用提供新的思路和支持，同時(shí)其臨床意義至關(guān)重要。
