1.打開Primer3Plus在線網(wǎng)頁（https://www.primer3plus.com/）進(jìn)行設(shè)計(jì)引物；

2.輸入序列（目的基因的CDS的核酸序列）；

輸入序列

3.進(jìn)行產(chǎn)物長度、引物大小等的設(shè)定（如圖所示）

對(duì)產(chǎn)物長度(一般為80-150bp)、引物長度、退火溫度及GC含量設(shè)定

4.點(diǎn)擊pick primers后得到結(jié)果；

結(jié)果展示

5.利用DNAMAN檢測(cè)引物是否存在發(fā)卡結(jié)構(gòu)：打開DNAMAN軟件，點(diǎn)擊primer-Load primer-From Input，輸入Forward引物；點(diǎn)擊Primer-Two Primer Complementarity-Second primer From Input，即可查看引物能否形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。

檢測(cè)結(jié)果（一般選擇少于四個(gè)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物）

6。滿足條件的即可確定為比較好的qPCR引物，發(fā)送至公司郵箱合成即可。

這只是設(shè)計(jì)qPCR引物的其中一種方法，大家可以選擇自己熟悉的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。