在探究功能基因的時(shí)候，我們經(jīng)常需要對(duì)所研究的基因/蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分組，逐個(gè)類(lèi)群探究蛋白功能。創(chuàng)建同源群可以采用Otrhofinder軟件，該軟件安裝方便，運(yùn)行快速，調(diào)用簡(jiǎn)單，可以說(shuō)是構(gòu)建同源群的神器。從OrthoFinder2.4.0版本開(kāi)始，同源群的劃分給予有根樹(shù)的層次，這種劃分方法比依靠相似度要更加準(zhǔn)確。此外，如果在推斷的過(guò)程中添加了外群物種，分群的精度有望進(jìn)一步提升[1]。
OrthoFinder 工作流程
- 調(diào)用 DIAMOND 對(duì)輸入序列進(jìn)行 all-vs-all 序列比對(duì)。diamond搜索速度快，非常適用于大量基因的相似度比對(duì)。
- 使用 MCL（Markov Cluster Algorithm） 算法根據(jù)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)，得到直系同源組（orthogroup）。其中每個(gè) orthogroup 的蛋白及序列信息存放在 Orthogroup_Sequences 文件夾中，單拷貝 orthogroup 的蛋白及序列信息存放在 Single_Copy_Orthologue_Sequences 文件夾中，orthogroup 的統(tǒng)計(jì)信息存放在 Comparative_Genomics_Statistics、Orthogroups 文件夾中。
- 使用 FastMe 對(duì)每個(gè) orthogroup構(gòu)建無(wú)根基因樹(shù)（gene tree）。
- 使用 STAG（Species Tree Inference from All Genes） 根據(jù)剛剛劃分好的包含所有物種的orthogroups中的同源基因推斷無(wú)根物種樹(shù)（species tree），此處會(huì)綜合考慮每一棵OG內(nèi)基因構(gòu)建的基因樹(shù)，匯總成為最終的物種樹(shù)。通過(guò)參數(shù) -M dendroblast 或 -M msa，OrthoFinder 可以調(diào)用 STAG 中兩種構(gòu)建物種樹(shù)的方法：DendroBLAST 和 CMSA（Concatenated Multiple Sequence Alignment，聯(lián)合多序列比對(duì)）。
- 使用 STRIDE（Species Tree Root Inference from Gene Duplication Events） 通過(guò)基因復(fù)制事件的不可逆性為無(wú)根物種樹(shù)、無(wú)根基因樹(shù)賦根，得到有根物種樹(shù)、有根基因樹(shù)、基因間的直系同源關(guān)系、基因復(fù)制事件。結(jié)果存放在文件夾 Species_Tree、Gene_Tree、Orthologues、Gene_Duplication_Events、Comparative_Genomics_Statistics 中。
1.創(chuàng)建環(huán)境并安裝orthofinder
conda create -n ogsfinder python=3.9.15 #太高版本的python，例如3.11在后面會(huì)報(bào)錯(cuò)。
conda activate ogsfinder
conda install -c bioconda orthofinder diamond=2.1.8 #錯(cuò)誤的diamond版本會(huì)報(bào)錯(cuò)。
2.運(yùn)行orthofinder尋找直系同源基因
將待尋找OGs的多個(gè)蛋白質(zhì)組文件存放于ExampleData文件夾，運(yùn)行orthofinder命令。指定運(yùn)行占用20個(gè)cpu（默認(rèn)使用16個(gè)cpu）。此處添加參數(shù)-M msa會(huì)進(jìn)行bootstrap檢驗(yàn)，最終看到的物種數(shù)是具有bootstrap值的。
orthofinder -f ExampleData -S diamond -t 20 -M msa
#-t 并行序列搜索線程數(shù)（默認(rèn)= 16）
#-a 并行分析線程數(shù)（默認(rèn)值= 1）
#-M 基因樹(shù)推斷方法?？蛇x：dendroblast和msa（默認(rèn)= dendroblast）推薦msa，可執(zhí)行帶有bootstrape的建樹(shù)
#-S 序列搜索程序（默認(rèn)= blast）選項(xiàng)：blast，mmseqs,，blast_gz，diamond（推薦使用diamond，比對(duì)速度很給力）
#-A 多序列聯(lián)配方式，需要添加參數(shù)-M msa時(shí)才有效；（默認(rèn)= mafft）可選擇：muscle，mafft
#-T 建樹(shù)方法，需要添加參數(shù)-M msa時(shí)才有效，（默認(rèn) = fasttree）可選：iqtree，raxml-ng，fasttree，raxml（推薦）
但是如需在構(gòu)建物種樹(shù)里加入bootstrape值則需要進(jìn)入程序的config.json文件修改對(duì)應(yīng)建樹(shù)軟件的e值或者新增-b 1000/-bb 1000。
運(yùn)行結(jié)束后會(huì)在ExampleData目錄下生成新的目錄OrthoFinder。
參考信息：
- Github OrthoFinder https://github.com/davidemms/OrthoFinder#getting-started-with-orthofinder
- orthofinder安裝及使用教程 http://www.itdecent.cn/p/3bcd965605f5
