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為什么read1和read2前幾個堿基的錯誤率較高？
測序儀先測完read1全長，才跳轉(zhuǎn)測read2，測序儀自身在剛啟動或關(guān)閉時不太穩(wěn)定，圖像識別質(zhì)量比較差，尤其是第一個堿基與最后一個堿基，測序質(zhì)量最差，緊挨著的幾個堿基測序質(zhì)量也偏高，一是測序儀從剛開始的不穩(wěn)定到穩(wěn)定，有一個過渡的過程。另外接頭空載，也會導(dǎo)致錯誤率上升。(ILLUMILA工程師的說法)
這是因為隨機引物擴增的偏好性導(dǎo)致的。隨機引物擴增偏好使得前邊一些堿基的堿基含量不平衡，因而在base-calling的時候算法不準(zhǔn)確，導(dǎo)致了錯誤率高。 所謂的開機儀器不穩(wěn)定其實解釋不了read2開始堿基錯誤率也高的問題。 DNA文庫沒有這種隨機引物反轉(zhuǎn)的過程，因而起始的幾個堿基的錯誤率就沒有明顯高。 也是同樣的道理，WGBS文庫因為堿基含量的不平衡，而導(dǎo)致錯誤率更高，在測序的時候就需要加入平衡文庫。
隨著測序的進行，flowcell可能會受到熒光的損害之類的，因而測read2的時候flowcell已經(jīng)和read1的時候不同了，因此read2的錯誤率會更高一些。當(dāng)然熒光損害的說法也不太能找到根據(jù)，而測過read1之后，可能flowcell變得更臟了卻是很好理解的。
為什么隨著read延長，測序錯誤率呈現(xiàn)升高趨勢？read2錯誤率要普遍高于read1錯誤率？
測序過程中，每個cycle在熒光基團淬滅，去3’端保護基團時，沒有完全去除，導(dǎo)致在延伸過程滯留，或者是加入了無3’端保護的堿基，導(dǎo)致延伸超前，滯留和超前引起延伸步調(diào)不一致，這是一個累積的過程，越是往后，超前或滯后的累積越多，測序錯誤率也就越高。另外，整個測序過程耗時較長，酶活性及試劑的有效性會隨著時間的延長而降低，測序過程先測read1，后測read2，所以read2的錯誤率要稍高于read1。另外，若待測片段中存在反向互補序列，容易發(fā)生折疊，導(dǎo)致堿基在合成時錯配（測序原理為邊合成邊測序）。對于特異性序列GGC，若后面的堿基是G，GGC這種結(jié)構(gòu)引起聚合酶偏好性的改變，會使錯誤率增高。
參考文獻
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