大家好！今天給大家介紹一篇關(guān)于胃癌（GC）診斷和預(yù)后特征的生信文章。文章中建立了GC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，重點關(guān)注T細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，用于細(xì)胞-細(xì)胞通訊分析、軌跡分析和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。發(fā)現(xiàn)了與T細(xì)胞相關(guān)的預(yù)后特征。根據(jù)這些預(yù)后特征將患者分為高風(fēng)險或低風(fēng)險組，可以有效地預(yù)測患者的生存率和腫瘤微環(huán)境的免疫浸潤狀態(tài)。文章思路簡單，方法不難可重復(fù)，感興趣的小伙伴不要錯過哦！

摘要

**背景 **胃癌( gastric cancer，GC )的早期診斷和預(yù)后預(yù)測是當(dāng)前GC治療臨床實踐中面臨的重大挑戰(zhàn)。因此，作者的目的是探索可以預(yù)測GC患者預(yù)后的相關(guān)基因特征。

方法 在本研究中，作者建立了GC的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，重點關(guān)注T細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，用于細(xì)胞-細(xì)胞通訊分析、軌跡分析和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析。此外，作者使用TCGA和GEO數(shù)據(jù)對胃癌患者的免疫相關(guān)預(yù)后基因特征進(jìn)行了驗證和預(yù)測。基于這些預(yù)后基因標(biāo)簽，作者通過將患者樣本分為高風(fēng)險或低風(fēng)險組來預(yù)測GC患者的免疫浸潤狀態(tài)。

結(jié)果 基于10例胃癌患者的腫瘤樣本和相應(yīng)的正常樣本，作者選取了18416個細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的單細(xì)胞測序分析。從中，作者鑒定了3284個T細(xì)胞，并從5種不同的T細(xì)胞亞型中獲得了641個與T細(xì)胞相關(guān)的差異表達(dá)基因。通過整合大量RNA測序數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)了與T細(xì)胞相關(guān)的預(yù)后特征。根據(jù)這些預(yù)后特征將患者分為高風(fēng)險或低風(fēng)險組，可以有效地預(yù)測患者的生存率和腫瘤微環(huán)境的免疫浸潤狀態(tài)。

結(jié)論 本研究探索了胃癌患者中與T細(xì)胞相關(guān)的預(yù)后基因特征，為預(yù)測患者的生存率和免疫浸潤水平提供了見解。

圖 1 研究工作流程

研究結(jié)果

胃癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

在本研究中，作者共分析了GSE183904數(shù)據(jù)集中的10個樣本，其中包括5例患者的腫瘤和正常組織樣本。每個樣本都進(jìn)行了初步篩選，以去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，結(jié)果保留了18416個細(xì)胞用于后續(xù)分析。然后，作者整合不同的樣本以消除批次效應(yīng)，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、中心化和PCA降尺度，然后使用t - SNE方法進(jìn)行聚類可視化。圖2A展示了不同樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，而圖2B展示了正常和腫瘤樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。聚類分析將18416個細(xì)胞分為25個簇，如圖2C所示。使用Single R包進(jìn)行細(xì)胞注釋發(fā)現(xiàn)8種細(xì)胞類型( 圖2D )：高表達(dá)PGC的上皮細(xì)胞、高表達(dá)XCL1的NK細(xì)胞、高表達(dá)C1Q8的巨噬細(xì)胞、高表達(dá)IL7R的T細(xì)胞、高表達(dá)IGLC2的B細(xì)胞、高表達(dá)POSTN的組織干細(xì)胞、高表達(dá)HLA - DRA的單核細(xì)胞和高表達(dá)PLVAP (圖2F和G)的內(nèi)皮細(xì)胞。圖2E為其在不同樣本中的比例，上皮細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞所占比例較高，而組織干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞所占比例相對較小。

圖 2 GC患者正常和腫瘤樣本的單細(xì)胞圖譜綜述。

scRNA-seq中T細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜和富集分析

GC scRNA-seq圖譜顯示在所有樣本中都存在大量的T細(xì)胞。因此，本研究從樣本中提取3284個T細(xì)胞，用于后續(xù)的聚類和標(biāo)注。圖3A顯示了T細(xì)胞再次聚類后的7個簇，圖3B顯示了T細(xì)胞的注釋，包括763個記憶CD8 T細(xì)胞，426個黏膜相關(guān)不變型T ( MAIT )細(xì)胞，297個調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，1017個T輔助細(xì)胞1/17 (Th 1/17)和781個Vδ2 T細(xì)胞。圖3C和D為每個T細(xì)胞亞型的標(biāo)記基因，包括GZMK、CCR6、trbv1 -1、LINC01871和BATF，圖3E為每個T細(xì)胞亞型的前10個DEGs。對T細(xì)胞相關(guān)的DEGs進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)它們主要富集在BP，如免疫系統(tǒng)過程的調(diào)節(jié)、免疫反應(yīng)和細(xì)胞活化(圖3F及附表S5)等。在細(xì)胞組分( CC )方面，主要集中在細(xì)胞表面、膜的一側(cè)和質(zhì)膜的外側(cè)。在分子功能( molecular function，MF )方面，它們主要參與信號受體結(jié)合、抗原結(jié)合和免疫球蛋白受體結(jié)合。KEGG富集分析顯示，T細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因主要參與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、MAPK信號通路和NF - κ B信號通路(圖3G)。

圖 3 scRNA-seq中T細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜。

細(xì)胞-細(xì)胞通訊分析

在這項研究中，作者采用CellChat功能來模擬不同類型細(xì)胞之間的配體-受體相互作用，從而產(chǎn)生細(xì)胞-細(xì)胞通信網(wǎng)絡(luò)（圖4A）。通過對該網(wǎng)絡(luò)信號通路的通路分析，作者發(fā)現(xiàn)了在細(xì)胞間通訊中頻繁出現(xiàn)的中期因子（MK）和巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）信號通路。發(fā)現(xiàn)MIF信號傳導(dǎo)途徑廣泛存在于各種類型細(xì)胞中的配體-受體相互作用中，其中CD74、CXR4和CD44在多種細(xì)胞類型中表現(xiàn)出更高的表達(dá)水平（圖4B-G）。

圖 4 細(xì)胞間通訊分析。

scRNA-seq中T細(xì)胞的偽時序分析

偽時序分析，又稱細(xì)胞軌跡分析，是根據(jù)單細(xì)胞樣本中時間基因的表達(dá)模式，模擬不同細(xì)胞的發(fā)育軌跡。在本研究中，作者提取T細(xì)胞來展示它們的發(fā)育軌跡，揭示了T細(xì)胞亞型的四個分支(圖5A)。圖5B和D表明T細(xì)胞在發(fā)育過程中表現(xiàn)出9種分化狀態(tài)，而圖5C和E描述了細(xì)胞亞型分化的時間順序，顏色較深的細(xì)胞逐漸過渡到顏色較淺的細(xì)胞。這說明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞屬于細(xì)胞發(fā)育的早期階段，而記憶性CD8 T細(xì)胞則屬于細(xì)胞分化的晚期階段，從第4分支到第2分支，再到第3分支，最后到第1分支。隨后，作者利用BEAM函數(shù)，通過熱圖展示了這四個不同分支的時間基因表達(dá)。通過GO富集分析探索BPs，結(jié)果表明，分支1主要與蛋白結(jié)合、適應(yīng)性免疫反應(yīng)、T細(xì)胞激活的正向調(diào)節(jié)、白細(xì)胞激活的調(diào)節(jié)有關(guān)。分支2主要與適應(yīng)性免疫反應(yīng)、對外界刺激反應(yīng)的正調(diào)控、對病毒的反應(yīng)有關(guān)。分支3主要與適應(yīng)性免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞死亡的正調(diào)控有關(guān)。最后，分支4主要與免疫球蛋白產(chǎn)生、T細(xì)胞分化和對趨化因子(圖5F – I )的反應(yīng)有關(guān)。可見，這些BPs主要參與T細(xì)胞分化和免疫應(yīng)答。

圖 5 scRNA-seq中T細(xì)胞的偽時間分析。

T細(xì)胞中TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

利用SCENIC功能預(yù)測TFs及其與T細(xì)胞相關(guān)的靶基因。最終選取前5個TFs (SPI1、TFF3、FOXP3、MYLK、GATA2)進(jìn)行分析(圖6A)。隨后，采用Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化，將TFs表示為綠色節(jié)點，對應(yīng)的靶基因表示為黃色節(jié)點(圖6B)。對這些靶基因進(jìn)行富集分析，氧化石墨烯分析結(jié)果顯示，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等bp中顯著富集(圖6C)。KEGG分析結(jié)果顯示，在腫瘤通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等通路中顯著富集(圖6D)。

圖 6 T細(xì)胞中TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析。

T細(xì)胞中預(yù)后基因簽名的預(yù)測和驗證

在TCGA-STAD數(shù)據(jù)集上進(jìn)行差異基因分析，將得到的1494個DEGs與scRNA-seq中的641個T細(xì)胞相關(guān)DEGs取交集，得到10個交集基因(圖7A )：MAL、HOPX、ARL4D、GKN1、HBB、CLIC3、GPR15、HPGD、MZB1和GBP5。首先，對這些基因的表達(dá)矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并采用LASSO回歸分析計算其風(fēng)險分?jǐn)?shù)。以TCGA-STAD數(shù)據(jù)集為訓(xùn)練集，GSE84437數(shù)據(jù)集為測試集，建立預(yù)后模型。根據(jù)風(fēng)險評分(圖7B-D , G)將患者分為高危組和低危組。Kaplan-Meier生存曲線顯示訓(xùn)練集和測試集(圖7E, H)的高風(fēng)險組預(yù)后均較差。時間依賴的ROC曲線分析顯示，在訓(xùn)練集( GC患者1年、3年和5年生存率的AUC約為0.6)和測試集(圖7F, I)中，預(yù)后特征在預(yù)測患者總生存期方面具有良好的性能。隨后，生成氣泡圖來可視化scRNA-seq中10個預(yù)后信號的表達(dá)(圖8A)。此外，我們還分析了這10個預(yù)后信號與22種免疫細(xì)胞類型之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)GBP5與多種T細(xì)胞亞型之間存在很強的相關(guān)性(圖8B)。

圖 7 T細(xì)胞中預(yù)后基因簽名的預(yù)測和驗證。

圖 8 T細(xì)胞和免疫細(xì)胞預(yù)后信號的相關(guān)性分析。

臨床相關(guān)性cox回歸分析及諾圖圖分析

為了進(jìn)一步闡明與胃癌相關(guān)的危險因素，并驗證現(xiàn)有預(yù)后基因標(biāo)簽的風(fēng)險評分，我們對患者的臨床信息進(jìn)行了Cox回歸分析。在單因素Cox回歸分析中，發(fā)現(xiàn)年齡( HR = 1.019 , 95 % CI = 1.001 ~ 1.037 , P < 0.05)、性別( HR = 1.482 , 95 % CI = 1.012 ~ 2.172 , P < 0.05)、腫瘤分期( HR = 1.559 , 95 % CI = 1.255 ~ 1.936 , P < 0.001)和風(fēng)險評分( HR = 1.947 , 95 % CI = 1.323 ~ 2.866 , P < 0.001)顯著影響患者的總生存期，并被確定為不良預(yù)后危險因素(圖9A )。在多因素Cox回歸分析中，年齡( HR = 1.031 , 95 % CI = 1.013 ~ 1.050 , P < 0.001)、腫瘤分期( HR = 1.678 , 95 % CI = 1.338 ~ 2.105 , P < 0.001)和風(fēng)險評分( HR = 2.326 , 95 % CI = 1.540 ~ 3.512 , P < 0.001)被確定為影響患者總生存期的獨立預(yù)后因素(圖9B )。隨后，利用GC患者的臨床數(shù)據(jù)，我們用R語言生成了列線圖。該列線圖對患者的年齡、性別、腫瘤T、N、M分期及危險度評分提供了相應(yīng)的分值，可以預(yù)測1年、3年、5年的生存概率(圖9C)。

圖 9 臨床風(fēng)險指標(biāo)分析。

預(yù)后基因簽名的免疫浸潤分析

為了進(jìn)一步探討高危組和低風(fēng)險患者組的預(yù)后信號與TME之間的關(guān)系，我們首先使用CIBERSORT算法對22種免疫細(xì)胞類型的比例進(jìn)行了可視化分析(圖10A)。隨后，在風(fēng)險分層的基礎(chǔ)上，利用ESTIMATE算法計算患者的免疫評分。結(jié)果顯示，高危組基質(zhì)評分較高(P < 0.0001)，而低風(fēng)險組免疫評分較高(P < 0.001)(圖10B-E)。此外，我們使用ssGSEA算法來分析高危和低風(fēng)險患者群體的免疫細(xì)胞比例。分析表明，低危組中CD8 T細(xì)胞、活化記憶CD4 T細(xì)胞、T濾泡輔助細(xì)胞、γδ T細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞的比例較高。相反，高危組表現(xiàn)出更高比例的靜息記憶性CD4 T細(xì)胞、單核細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞和幼稚B細(xì)胞(圖10F )。這些發(fā)現(xiàn)表明，與高風(fēng)險組相比，低風(fēng)險組患者具有抗腫瘤活性的免疫細(xì)胞比例更高，表明免疫浸潤在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的主要作用。

圖 10 T細(xì)胞預(yù)后基因特征的免疫浸潤分析

結(jié)論

在本研究中，作者利用scRNA-seq方法構(gòu)建胃癌單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，探索T細(xì)胞在細(xì)胞軌跡、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞-細(xì)胞通訊機制中的作用。此外，作者將單細(xì)胞樣本與TCGA和GEO數(shù)據(jù)整合，以預(yù)測和驗證與T細(xì)胞相關(guān)的預(yù)后基因特征，使作者能夠預(yù)測患者1年、3年和5年生存率。此外，作者觀察到這些預(yù)后基因特征也具有預(yù)測TME內(nèi)免疫浸潤的能力。