前段時(shí)間，估計(jì)2個月之前了吧，Nature Commnication 上發(fā)了一篇史上最強(qiáng)RNA-Seq數(shù)據(jù)分析測評文章，本來一直想介紹一下的，但是尷尬的是實(shí)驗(yàn)室一直沒來RNA-Seq數(shù)據(jù)讓我分析，所以就一直沒寫文章提供的"RNACocktail"，現(xiàn)在終于能夠?qū)懸幌氯绾尾贾肦NACocktail的工作環(huán)境了。

官方地址：【https://bioinform.github.io/rnacocktail/】

如果你懂docker，并且有管理員權(quán)限，那你可以嘗試他們提供的docker image, 也就是docker pull marghoob/rnacocktail.但這里，我們采用的是conda進(jìn)行軟件管理，為了保證環(huán)境的一致性和穩(wěn)定性，我重新建立一個虛擬環(huán)境，國內(nèi)用戶可以需要添加清華鏡像源提高下載速度（后面提到的配置文件里設(shè)置了清華鏡像源）。

按照往常，我可能要把每一行下載的代碼都要羅列出來才行，但是conda install有一個選項(xiàng)是-file, 通過已有的環(huán)境設(shè)置參數(shù)文件，一步搞定。我的配置文件放在我的GitHub上，下載后用conda install --file fileName.txt進(jìn)行安裝。

注意，RNACocktail是大雜燴的體系，下面不同步驟及其對應(yīng)的主要軟件

• 比對，align, HISAT2
• 轉(zhuǎn)錄本重建，reconstruct, StringTie
• 基因定量，quantify, Salmon-SMEM
• 差異表達(dá)，diff, DESeq2
• 短讀長序列從頭組裝，denovo, Oases
• 長讀長序列矯正，long_correct， loRDEC
• 長讀長序列比對，long_align， STARlong
• 長讀長序列轉(zhuǎn)錄本重建，long_reconstruct，IDP
• 長讀長序列轉(zhuǎn)錄融合檢測，long_fusion, IDP-fusion
• 變異位點(diǎn)識別，variant，GATK
• RNA編輯檢測，editing， GIREMI
• RNA融合檢測，fusion， FusionCatcher

并且，最后以上步驟最后都加入了all豪華套餐。
那么問題來了，我目前不需要三代測序，也不需要做RNA edit 和 fusion的分析，主要工作就是基因定量和差異表達(dá)分析，我不需要安裝所有的軟件。

安裝方法：

我提供的requirement.txt文件安裝的軟件是RNACocktail流程的中配版本，而且我以身試坑，能夠運(yùn)行。大家可以根據(jù)需要，在此基礎(chǔ)上添加不同口味的軟件。

# 方法1，自定義環(huán)境名
conda env create -n rnacocktial(名字隨意) -f=requiremment.txt
# 方法2， 指定安裝路徑
crate env create -p $HOME/software/rnacocktail（路徑自選） -f=requiremment.txt

如下是我將服務(wù)器導(dǎo)出環(huán)境配置文件，在我本地電腦上運(yùn)行的示例圖。

以身測坑

最后需要自己安裝作者放在GitHub上最新版本的RNACocktial

source activate rnacocktail
pip install https://github.com/bioinform/RNACocktail/archive/v0.2.1.tar.gz

如果不需要可以一鍵刪除,

conda env remove -n rnacocktial

定量流程測試

由于安裝的軟件版本和官方的未必一樣，需要先用quantify這一步探探雷。官方給的推薦命令如下：

run_rnacocktail.py quantify 
    --quantifier_idx salmon_fmd_idx  # 使用salmon index -t reference.fa -i salmon_index_basename --type fmd 構(gòu)建
    --1 seq_1.fq.gz --2 seq_2.fq.gz #雙端測序
    --libtype IU  # 無鏈特異性，雙端
    --salmon_k 19 # salmon教程75bp以上推薦31
    --outdir out # 
    --workdir work  
    --salmon /path/to/salmon #salmon所在位置
    --threads 10 #線程數(shù)
    --sample A #表示樣本A
    --unzip # 解壓

之前寫過是時(shí)候來一波RNA-Seq差異表達(dá)分析實(shí)操了 用的就是salmon,剛好能派上用場。
下載（擬南芥cDNA)序列，也就是轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，建立索引

# downlaod data from ensemblgenomes
curl ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-28/fasta/arabidopsis_thaliana/cdna/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.28.cdna.all.fa.gz -o athal.fa.gz
# build quasi-mapping-based index
salmon index -t athal.fa.gz -i Athaliana --type fmd

使用run_rancocktail對樣本定量

for fn in ERR1698{194..209};ERR1698{194..209};
do
    samp=`basename ${fn}`
    echo "Processin sample ${sampe}"
    run_rnacocktail.py quantify \
    --quantifier_idx /public1/wangjw/database/TAIR10/Athaliana/\
    --1 ${samp}_1.fastq.gz \
    --2 ${samp}_2.fastq.gz \
    --libtype IU  \
    --salmon_k 31\
    --workdir data \
    --salmon $PATH/miniconda3/envs/rnacocktail/bin/salmon \
    --threads 10 \
    --sample ${sampe} \
    --unzip 

運(yùn)行成功

最后結(jié)果會存放在 data/salmon-smem下（截圖是目前分析的數(shù)據(jù)），說明配置沒有問題。
GITHUB地址：
https://github.com/xuzhougeng/zgtoolkits/blob/master/requirement_of_rnacocktial.txt 一不小心被我刪了。。尷尬