在生物醫(yī)學(xué)研究和基因功能探索中，條件性基因敲除技術(shù)占據(jù)了舉足輕重的地位。其中，Cre-LoxP 系統(tǒng)以其獨(dú)特的工作原理和廣泛的應(yīng)用場景，成為了研究基因功能不可或缺的利器。今天，我們就來深入了解這一強(qiáng)大的基因編輯工具——Cre-LoxP 系統(tǒng)。

01

什么是 Cre-LoxP 系統(tǒng)？

Cre-LoxP 系統(tǒng)是一種基于位點(diǎn)特異性重組的基因編輯技術(shù)，由 Cre 重組酶和 LoxP 位點(diǎn)兩部分組成。

圖 1. Cre-loxP system[1]。

Cre 重組酶?(Cyclization Recombination Enzyme)?由噬菌體 P1 的環(huán)化重組酶基因產(chǎn)生的一個 38 kDa 的 DNA 重組酶，可以識別 loxP?(locus of x-over, P1)?位點(diǎn)的特定 DNA 片段序列，并介導(dǎo)兩個 loxP 位點(diǎn)之間 DNA 序列的位點(diǎn)特異性缺失。

loxP 位點(diǎn)是一個 34 bp 的序列，由兩個 13 bp 的反轉(zhuǎn)和回文重復(fù)序列和 8 bp 的核心序列組成。Cre-loxP 主要用于基因敲除，但它也會根據(jù) loxP 位點(diǎn)的取向和位置誘導(dǎo)兩個 loxP 位點(diǎn)之間的 DNA 反轉(zhuǎn)和易位[1]。

02

常用的 Cre-loxP 誘變系統(tǒng)

圖 2.? Cre-loxP 誘變系統(tǒng)的原理[1]。

? Cre-ER (Tam) 系統(tǒng)

Cre-ER?(Tam)?系統(tǒng)，也稱為他莫昔芬 (Tamoxifen)（詳情：https://www.medchemexpress.cn/Tamoxifen.html）?誘導(dǎo)的 Cre 系統(tǒng)，是 Cre-LoxP 系統(tǒng)中最為常用的一種誘導(dǎo)型系統(tǒng)[1][2]。

圖 3. Cre-ERT 基因敲除小鼠案例[3]。

A. Cre-ERT 小鼠模型的構(gòu)建? B. 他莫昔芬誘導(dǎo)后，PDGFBNull-MG 小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元表現(xiàn)出?Kcnd3表達(dá)的降低。

該系統(tǒng)通過將 Cre 重組酶與與含有突變配體結(jié)合域的雌激素受體?(ER-LBD)?融合，形成 CreER 融合蛋白。在沒有 Tamoxifen 的情況下，CreER 融合蛋白與熱休克蛋白 90?(HSP90)?相互作用并定位于細(xì)胞質(zhì)中。給予他莫昔芬/ 4-羥基他莫昔芬后，會破壞 HSP90 與 CreER 的相互作用，使 CreER 進(jìn)入細(xì)胞核，識別并切割 LoxP 位點(diǎn)間的 DNA 序列，從而實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除[1]。

為了提高他莫昔芬或 4-OHT 誘導(dǎo)的效率，在 CreERT 后產(chǎn)生 CreERT2，它在體內(nèi)對 4-OHT 的敏感性約為 CreERT 的 10 倍。因此，CreERT2 在一些生物學(xué)領(lǐng)域更受青睞[2]。

? Tet-on 與 Tet-off 系統(tǒng)

除了 Cre-ER?(Tam)?系統(tǒng)外，Tet-on 和 Tet-off 系統(tǒng)也是常用的條件性基因表達(dá)系統(tǒng)。Tet 系統(tǒng)由逆四環(huán)素控制的激活劑?(rtTA)、四環(huán)素控制的激活劑?(tTA)?和四環(huán)素響應(yīng)元件?(TRE，也被稱為四環(huán)素操縱子 TetO，它調(diào)節(jié) cre 基因的表達(dá))?三部分組成。

圖 4. DOX 誘導(dǎo)的 Cre 系統(tǒng)[4]。

A. 構(gòu)建模型，DOX 激活了在 SP-C 啟動子控制下表達(dá)的 rtTA。B-D. 妊娠期間用強(qiáng)力霉素來誘導(dǎo)的 Cre 介導(dǎo)的 floxed AP 或 GFP 基因的激活。

Tet-on 系統(tǒng)通過四環(huán)素(Tetracycline)（詳情：https://www.medchemexpress.cn/Tetracycline.html） 或其衍生物多西環(huán)素(Doxycycline)(詳情：https://www.medchemexpress.cn/doxycycline.html）?的添加來激活基因表達(dá)。在三重轉(zhuǎn)基因動物中，rtTA 在 SP-C 啟動子的控制下在上皮細(xì)胞中表達(dá)。Doxycycline?(DOX)與?rtTA?結(jié)合，激活Cre的表達(dá)，導(dǎo)致固定的報(bào)告基因重組(圖4A)。而 Tet-off 系統(tǒng)則相反，在去除四環(huán)素時(shí)激活基因表達(dá)[1]。

03

Cre-loxP 基因敲除小鼠的構(gòu)建方法

1.?構(gòu)建 Flox 小鼠：首先，將 LoxP 序列插入到需要刪除 DNA 區(qū)域的兩端，這一區(qū)域通常被稱為 flox 區(qū)。獲得的小鼠稱為 Flox 小鼠，其基因功能在正常情況下保持不變。

2. 選擇 Cre 工具鼠：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇具有組織或細(xì)胞特異性啟動子的 Cre 工具鼠。這些小鼠能夠在特定的組織或細(xì)胞中表達(dá) Cre 重組酶。

3. 雜交與篩選：將 Flox 小鼠與 Cre 工具鼠進(jìn)行雜交，通過多代交配篩選出同時(shí)攜帶 Flox 基因和 Cre 基因的小鼠。這些小鼠在特定組織或細(xì)胞中，當(dāng) Cre 重組酶表達(dá)時(shí)，會實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除[1]。

圖 5. Cre-loxP 基因敲除小鼠一般育種原則[1]。

? 誘導(dǎo)方法

藥物方法

Tamoxifen（詳情：https://www.medchemexpress.cn/Tamoxifen.html)Adult PdgfbNull-MG mice; 75 mg/kg Tamoxifen (dissolved in corn oil) intraperitoneal injection (i.p.) for 5 consecutive days[3].

Hif1af/f; Foxl2-CreERT2 female mice (3 weeks); 100 mg/kg Tamoxifen (freshly dissolved in sunflower oil) intraperitoneal injection (i.p.) for 5 consecutive days[5].?

Doxycycline(詳情 :https://www.medchemexpress.cn/doxycycline.html)C57BL/6 tetO-Cre mice (TRE-Cre); 600 mg/kg Doxycycline-containing diet for 14 days[6].

?知識鏈接

Tamoxifen、四環(huán)素、多西環(huán)素均不溶于水，使用時(shí)注意使用助溶劑或超聲助溶。

Tamoxifen?是 Cre-loxP 模型中最常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑，不溶于水，一般溶于乙醇、玉米油或葵花籽油中使用，-20℃ 避光保存，使用前可 37℃ 下解凍并超聲 5 分鐘。

成年小鼠給藥Tamoxifen?劑量范圍為 75 mg/kg~100 mg/kg，給藥方式可以選擇口服、灌胃或者腹腔注射，目前最常用的是連續(xù)5天腹腔注射的方式。

給藥劑量和頻率需根據(jù)實(shí)驗(yàn)動物的種類、年齡、體重以及實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡纫蛩卮_定，并遵循實(shí)驗(yàn)動物倫理和實(shí)驗(yàn)規(guī)范[7][8][9]。

?注意事項(xiàng)[8]

處理過的動物和未處理過的動物應(yīng)分開飼養(yǎng)，關(guān)在同一個籠子里，可能會發(fā)生他莫昔芬交叉污染。舔舐油性他莫昔芬懸浮液，梳理或食糞行為可以引起基因敲除。

誘導(dǎo)后，需要等待一段時(shí)間?(如數(shù)小時(shí)至數(shù)天)?以允許 Cre 重組酶進(jìn)入細(xì)胞核并發(fā)揮作用。

可以通過分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法驗(yàn)證是否敲除成功。如：Western blot、PCR、測序、組織學(xué)檢查。

04

小結(jié)

大家在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中要進(jìn)行根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮突虮磉_(dá)特性選擇合適的誘導(dǎo)時(shí)間，過早或過晚的誘導(dǎo)都可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在使用這些藥物時(shí)，需要綜合考慮實(shí)驗(yàn)需求、藥物特性以及實(shí)驗(yàn)動物的生理狀態(tài)等因素，以確保實(shí)驗(yàn)的成功和結(jié)果的可靠。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kim H, et al. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 2018 Dec;34(4):147-159.?

[2] Indra AK, et al. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ER(T) and Cre-ER(T2) recombinases. Nucleic Acids Res. 1999;27(22):4324-4327.?

[3] Bi Q, et al. Microglia-derived PDGFB promotes neuronal potassium currents to suppress basal sympathetic tonicity and limit hypertension. Immunity. 2022 Aug 9;55(8):1466-1482.e9.

[4] Perl AK, et al. Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation of the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(16):10482-10487.

[5] H, Wang J. FSHR-mTOR-HIF1 signaling alleviates mouse follicles from AMPK-induced atresia. Cell Rep. 2023 Oct 31;42(10):113158.

[6] Lewis KT, et al. Tetracycline response element driven Cre causes ectopic recombinase activity independent of transactivator element. Mol Metab. 2022 Jul;61:101501.

[7] Donocoff RS, et al. Optimization of tamoxifen-induced Cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 2020;10(1):15244.?

[8] Feil S, Valtcheva N, Feil R. Inducible Cre mice. Methods Mol Biol. 2009;530:343-63.

[9] Jahn HM, et al. Refined protocols of tamoxifen injection for inducible DNA recombination in mouse astroglia. Sci Rep. 2018 Apr 12;8(1):5913.