“SnapGene是構建質(zhì)粒的利器。”

????????上次介紹了雙酶切克隆和TA克隆，這次介紹一種和TA克隆比較相似的TOPO克隆，唯一的區(qū)別就是TA克隆用的是T4連接酶把PCR片斷連接到T載體上，而TOPO克隆是基于拓撲異構酶(Toposiomerase)的克隆，是一種不利用限制酶和連接酶的DNA克隆方法，該技術依賴于A和T堿基的互補配對，因此也可以稱為TOPO-TA，用于黏性末端；當然也可用于平末端的連接。

????????這一部分以PDCD-1(程序性死亡受體1)為目的片段，使用TOPO克隆方式進行構建目的載體。

1. TOPO克隆作用機制

拓撲異構酶(Toposiomerase)是存在于細胞核內(nèi)的一類酶，他們能夠催化DNA鏈的斷裂和結合，從而控制DNA的拓撲結構，拓撲異構酶參與了超螺旋結構模版的調(diào)節(jié)。

?PCR反應中所使用的聚合酶具有末端轉(zhuǎn)移的活性，PCR反應時在每條PCR擴增產(chǎn)物的3`端自動添加一個3`-A突出端。TOPO克隆使用了牛痘病毒中分離出的拓撲異構酶I，識別DNA序列5'-(C/T)CCTT-3'并在此序列上酶切雙鏈DNA，暴露出T位點同時DNA斷裂釋放的能量儲存在其 3'胸腺嘧啶脫氧核苷的磷酸基團和拓撲異構酶I上的酪氨酸殘基之間的共價鍵中。它在識別位點切割DNA一條鏈，然后使其解鏈，之后TA配之后酶會重新連接被切割的位點，并將自身從DNA上釋放出來。下圖為黏性末端和平末端基礎機制。

Taq擴增的DNA的TOPO TA Cloning

利用Zero Blunt TOPO克隆方法克隆平末端DNA。

利用定向TOPO克隆方法克隆平末端DNA。

圖片來自于賽默飛官網(wǎng)

2. TOPO工作流程

????基本上和TA克隆是相似的，感興趣的可以看看前面的。這里簡略介紹一下，就是目的片段擴增好之后與TOPO質(zhì)粒載體共孵育5min即可進行下一步的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化。

3. 目的片段的獲取

在NCBI上按照上次的方法找到PDCD-1的CDS片段，然后導入到snapgene中，做好自己想要的特征標記。

4. TOPO克隆

1. 將目的片段選擇好之后，選擇作為PCR模板，用來設計后續(xù)的引物；也可以按自己需求直接作為模板。

??????? 2. 選擇合適滿足自己需求TOPO-TA克隆的質(zhì)粒載體。

3. 選擇引物，snapgene會按照Tm設計好擴增引物

??????? 4. 點擊克隆，名字取好，就可將目的質(zhì)粒保存好，進行后續(xù)的研究。

同理，TOPO平端克隆也是同樣的操作。

同理，TOPO定向克隆也是同樣的操作。

5. 模擬電泳

模擬電泳是snapgene中非常有趣和實用的一個功能，在這里補充介紹一下。

上圖是電泳界面，簡單一一介紹一下。

1.?電泳圖譜

和實際電泳圖跑出來非常相似，可以用來提前預測結果，然后進行結果對照，查看問題點在哪里，下方是泳道信息調(diào)整和相對應的工具欄。

2. 泳道調(diào)整和酶切位點的選擇

進行每一個泳道的調(diào)整和選擇相應的酶切位點進行電泳。

3.?質(zhì)粒圖譜

質(zhì)粒圖譜和相對應的工具欄，和之前的界面是一樣的，都可以進行操作。

????泳道1 是線性PCDC1的電泳圖

泳道2 是質(zhì)粒的超螺旋電泳圖，能夠明顯看到質(zhì)粒是6708bp分子量，但是超螺旋的質(zhì)粒明顯在6kb marker下面，這主要是因為DNA在超螺旋后，改變了自身的拓撲結構，消除了部分溶液中與其作用的氫鍵，使DNA磷酸骨架中更多的負電荷直接暴露在了電場之中，在電泳的作用下，其可更快速的移動至正極，使得電泳結果看起來分子量要偏小一些。

泳道3 是使用一個酶切線性化后的電泳圖，分子量就符合預期。

泳道4 是使用兩個酶酶切后的電泳圖

泳道5 是使用引物擴增之后得到產(chǎn)物的電泳圖，可用來鑒定。

????最后一個TOPO克隆設計就完成了，另外還介紹了模擬電泳的使用。這只是前面最基礎的設計部分，依靠軟件即可完成，后續(xù)的鑒定，轉(zhuǎn)化，驗證，表達，純化等等都需要大量的學習才能順利完成，希望這部分內(nèi)容能對大家有所幫助。