劉小澤寫于18.9.7

各行各業(yè)數(shù)據(jù)呈爆炸式增長，大量的數(shù)據(jù)等待被處理，R語言就是一個(gè)利器，可以說是做數(shù)據(jù)分析必備的編程語言。當(dāng)強(qiáng)大的R與包羅萬象的生物結(jié)合，再一次刺激了R的迅猛發(fā)展。隨著NGS測(cè)序的普及，R語言的生信專業(yè)社區(qū)Bioconductor誕生，開啟了生物信息的R語言時(shí)代。
好工具，用起來，首先要了解生物數(shù)據(jù)與R之間的關(guān)聯(lián)

生物知識(shí)回顧

• 基因有三類：第一類編碼序列，編碼蛋白【轉(zhuǎn)錄+翻譯功能】；第二類只有轉(zhuǎn)錄沒有翻譯功能【tRNA+rRNA】；第三類不轉(zhuǎn)錄基因，調(diào)控基因表達(dá)【啟動(dòng)子、操縱子】
• 基因組：單倍體細(xì)胞中包含編碼序列和非編碼序列的全部DNA【核基因組+線粒體基因組+葉綠體基因組】
• 狹義轉(zhuǎn)錄組：mRNA，代表樣本整體基因表達(dá)水平，一般稱為“表達(dá)譜”【真正的表達(dá)譜是蛋白質(zhì)組信息，研究手段是質(zhì)譜】。通常用基因芯片、RNA-seq
• 廣義轉(zhuǎn)錄組：
  • 非編碼ncRNA：有三類【按長度劃分】
    • 小于50nt的small RNA【長度單位：單鏈叫nt，雙鏈叫bp】：miRNA、siRNA、piRNA【small RNA序列短，同源性高，一般采用二代測(cè)序檢測(cè)】
    • 50-500nt：rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA
    • 大于500nt：mRNA-like ncRNA、不帶polyA尾的ncRNA
  • microRNA：也叫miRNAs，20-25nt，初級(jí)轉(zhuǎn)錄物-》核酸酶剪切加工-〉組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體-》互補(bǔ)配對(duì)識(shí)別靶mRNA-〉根據(jù)互補(bǔ)程度不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏mRNA翻譯
• DNA、蛋白互作：Chromatin immuopre-cipitation, ChIP，主要應(yīng)用于：DNA序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（Binding sites）識(shí)別 ，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等順式作用文件(Cis-acting element)的識(shí)別；DNA甲基化、組蛋白修飾、核小體定位
• DNA甲基化：甲基化DNA免疫共沉淀測(cè)序(Methylated DNA immunoprecipitation sequencing, MeDIP-seq)、甲基化DNA（蛋白）結(jié)合域測(cè)序(Methylated DNA binding domain sequencing, MBD-seq)和亞硫酸氫鹽測(cè)序(Bisulfite sequencing, BS-seq)

基因表達(dá)分析

基因表達(dá)檢測(cè)方法

• 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real time PCR, qRT-PCR)
• 基因（表達(dá)譜）芯片（Microarray）
• 表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tag, EST）
• 基因表達(dá)系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)
• 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

PCR技術(shù)應(yīng)用最為成熟，靈敏度高，特異性強(qiáng)，但其缺點(diǎn)是通量較??；基因芯片方便快捷，適合臨床診斷及個(gè)體基因組分析；基因測(cè)序技術(shù)通量高，但周期長、成本高

基因芯片是什么

基因芯片又稱DNA微陣列，按照檢測(cè)物的不同，可分為DNA芯片、RNA芯片等，其中DNA芯片又可分為單核苷酸多肽性（SNP）芯片、比較基因組雜交（CGH）芯片等。

基因芯片原理

主流寡聚核苷酸芯片主要有：Affymetric、Agilen、Illumina公司

基因表達(dá)數(shù)據(jù)

矩陣表示：行名代表一個(gè)基因不同條件/樣本的表達(dá)，列名代表某個(gè)條件/樣本的所有基因表達(dá)。數(shù)據(jù)代表表達(dá)水平。那么一般分析什么？

• 不同樣本/處理中哪些基因表達(dá)有顯著差異？
• 基因之間有什么共有的功能，或者參與哪些共同代謝途徑？
• 不同的處理中，哪些基因變化一致，它們受到上游哪些基因的調(diào)節(jié)，或者它們控制下游哪些基因的表達(dá)？
• 哪些基因表達(dá)存在樣本特異性，也就是說通過他們的表達(dá)可以判斷樣本的狀態(tài)（如：細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、應(yīng)激、癌變等）

主要的分析

主要有差異顯著性分析和時(shí)間序列分析，后者主要是測(cè)定基因多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量，然后聚類+主成分分析尋找共調(diào)控基因

表達(dá)顯著性分析就是為了找差異基因（DEG）。那么怎樣判斷基因間是有差異的呢？常用的有3種算法：一是倍數(shù)分析（無統(tǒng)計(jì)假設(shè)），計(jì)算每個(gè)基因在不同條件/樣本的比值，再與閾值比較；二是用統(tǒng)計(jì)模型T檢驗(yàn)等方法，計(jì)算差異表達(dá)的置信度p值，以0.05或者0.01作為閾值；三是機(jī)器學(xué)習(xí)方法，利用貝葉斯模型、隨機(jī)森林等。分析的結(jié)果從來不用擔(dān)心沒有差異基因，而是要考慮差異基因可能存在很多，從幾十個(gè)到上百個(gè)不等，那么如何展示他們呢，一張簡單粗暴的大表格嗎？肯定是不行的！

需要把上游的這些差異基因再進(jìn)行注釋、分組，一個(gè)類別就相當(dāng)于一個(gè)GO term，然后看這幾大類的區(qū)別，肯定比看幾十甚至上百個(gè)基因或蛋白的差異要更加直觀，這就是富集分析，包括GO分析，KEGG分析，GSEA分析等。其中重點(diǎn)研究的基因集叫做前景基因，需要比對(duì)的所有基因集叫背景基因，前景是背景的子集。例如轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的對(duì)照組和處理組，處理與對(duì)照之間的差異基因就是前景基因，兩組所有的表達(dá)基因就是背景基因。富集分析的目的就是根據(jù)不同功能，把各個(gè)分子進(jìn)行分類，然后使用超幾何分布檢驗(yàn)進(jìn)行分析。當(dāng)然使用不同工具，得到的結(jié)果不同，現(xiàn)在clusterProfiler要比DAVID的結(jié)果更多。

GO分析（Gene Ontology）

包括GO terms（標(biāo)簽）+GO annotations（注釋）。

• GO terms存在于由基因本體聯(lián)合會(huì)(Gene Ontology Consortium)建立的數(shù)據(jù)庫中，對(duì)基因和蛋白功能進(jìn)行限定和描述，每個(gè)注釋信息都有一個(gè)GO ID。它由兩部分構(gòu)成，第一部分都是GO，第二部分是以0開頭的7位數(shù)字，例如GO:0016021 。

  GO是一個(gè)情報(bào)員，他負(fù)責(zé)調(diào)查：包括基因的分子功能：“干啥的”（molecular function，MF），指分子所執(zhí)行的任務(wù)【如與碳水化合物結(jié)合或ATP水解酶活性等】、細(xì)胞組分：“活動(dòng)區(qū)域”即產(chǎn)物發(fā)揮作用的位置（cellular component，CC）【如核仁、端粒和識(shí)別起始的復(fù)合物】、參與的生物過程：“近期有什么動(dòng)靜”（biological process，BP）【嘌呤代謝、有絲分裂等】GO調(diào)查完就給被查對(duì)象貼標(biāo)簽term

• GO annotations即GO注釋，是針對(duì)基因產(chǎn)物的而不是基因，表示某些基因的產(chǎn)物是是非編碼RNA、蛋白質(zhì)還是大分子等。這里GO就相當(dāng)于一個(gè)中間媒介，它對(duì)基因進(jìn)行定義GO term，然后其他各個(gè)數(shù)據(jù)庫使用GO的定義方法，對(duì)它們的基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)注，例如一個(gè)數(shù)據(jù)庫的EntrezID或SYMBOL與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行ID對(duì)應(yīng)，或者用一個(gè)數(shù)據(jù)庫的序列與GO term進(jìn)行對(duì)應(yīng)。

在一個(gè)GO注釋中，例如，一個(gè)基因的產(chǎn)物是細(xì)胞色素c（cytochrome c），那么這個(gè)基因的產(chǎn)物就會(huì)被一個(gè)分子功能術(shù)語（Molecular Function）描述為氧化還原酶活性（oxidoreductase activity ），被生物過程（Biological Process）描述為氧化磷酸化（oxidative phosphorylation ），被細(xì)胞成分（Cellular Component ）描述為線性體基質(zhì)（mitochondrial matrix ）和線粒體內(nèi)膜（mitochondrial inner membrane ）~引用自“讀研筆記”

pathway代謝通路

GO負(fù)責(zé)分門別類，而pathway負(fù)責(zé)把每一類對(duì)應(yīng)到具體的代謝網(wǎng)絡(luò)中。研究pathway的原因是：生物學(xué)問題中設(shè)定一個(gè)“蝴蝶效應(yīng)”假設(shè)：1個(gè)Pathway上游基因的改變，會(huì)導(dǎo)致下游相關(guān)基因改變，從而改變通路中大量基因的表達(dá)?，F(xiàn)在常用是KEGG，但是它收錄的都是是已有的研究結(jié)果，而這些信息，還沒有完善

熟悉一下Bioconductor

Bioconductor擁有上千個(gè)擴(kuò)展包，主要有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)包、軟件包、注釋數(shù)據(jù)包三大類，例如白血病的ALL包就是利用Affymetrix進(jìn)行芯片分析的數(shù)據(jù)包；但最重要的當(dāng)屬軟件包

軟件包：

1. 注釋：GO、Pathway等

2. 微陣列板塊（Assay Domains）：處理芯片數(shù)據(jù)，Bioconductor支持主流的Affymetrix的商業(yè)化單色寡聚核苷酸芯片，也支持用戶定制的雙色cDNA芯片。芯片數(shù)據(jù)一般流程：數(shù)據(jù)預(yù)處理、差異表達(dá)基因篩選、聚類分析。這里的包有以下幾部分：

   • 比較基因組雜交（Comparative Genomic Hybridization, CGH）
   • 細(xì)胞水平檢測(cè)（Cell Based Assays）
   • 染色質(zhì)免疫共沉淀芯片（ChIPchip）
   • 拷貝數(shù)變異（Copy Number Variants）
   • CpG島（CpGIsland）
   • 差異表達(dá)（Differential Expression）
   • DNA甲基化（DNA Methylation）
   • 外顯子檢測(cè)（Exon Assay）
   • 基因表達(dá)（Gene Expression）
   • 遺傳變異性（Genetic Variability）
   • 單核苷酸多態(tài)性（SNP）
   • 轉(zhuǎn)錄

3. 測(cè)序技術(shù)（Assay techs）

   • 芯片技術(shù)（Microassay）
   • 微孔板檢測(cè)（Microtitre Plate Assay?）
   • 質(zhì)譜（Mass Spectrometry）
   • 基因表達(dá)系列分析（SAGE）
   • 流式細(xì)胞儀（Flow Cytometry）
   • NGS

4. 數(shù)據(jù)處理：基因芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理（背景矯正、歸一化、質(zhì)控）、芯片分析、基因間關(guān)系、樣本間關(guān)系、識(shí)別差異基因

   聚類分析（Clustering）、分類（Classification）、富集分析（Enrichment）、多組比較（Multiple Comparison）、預(yù)處理（Preprocessing）、質(zhì)控、序列匹配、時(shí)間序列分析（Time Course）、可視化、網(wǎng)絡(luò)分析

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