劉小澤寫于2020.3.27
ChIP-Seq的目的是研究感興趣蛋白在基因組上的結(jié)合位點(diǎn)，可以用來鑒定轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor, TF）的結(jié)合位點(diǎn)或者轉(zhuǎn)錄后更廣范圍的組蛋白修飾（histone marks），一般與調(diào)控元件有關(guān)。
高通量測序（high-throughput sequencing ,HTS）2005年首次提出，平臺包含了：二代測序Illumina/Solexa, Roche/454, SOLiD (ABI), Ion Torrent以及三代測序Pacbio（曾打算被illumina以12億美元收購，但未成功）, Oxford Nanopore。這里主要討論illumina產(chǎn)出的數(shù)據(jù)（畢竟現(xiàn)在市場份額最大，2018年達(dá)到83.9%），其他平臺也是類似，只不過在文庫制備、測序的步驟有差別。
染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation ，ChIP）技術(shù)誕生很早，由Orlando等人創(chuàng)立于1997年，發(fā)表于2000年，先利用Microarray技術(shù) ChIP-chip，后2007年利用DNA sequencing技術(shù) ChIP-seq。
詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟：
- 交聯(lián)染色質(zhì)免疫沉淀的 ChIP 方案 (crosslinking/X-ChIP=》主流)：https://www.abcam.cn/protocols/cross-linking-chromatin-immunoprecipitation-x-chip-protocol-2
- 自然染色質(zhì)免疫沉淀方案 (native/N-ChIP)：https://www.abcam.cn/protocols/native-chromatin-immunoprecipitation-protocol
染色質(zhì)準(zhǔn)備
整個流程從福爾馬林對染色質(zhì)上的蛋白與DNA交聯(lián)開始
染色質(zhì)是指間期細(xì)胞核內(nèi)由DNA、組蛋白、非組蛋白及少量RNA 組成的線性復(fù)合結(jié)構(gòu)，是間期細(xì)胞遺傳物質(zhì)存在的形式
染色體是指細(xì)胞在有絲分裂或減數(shù)分裂過程中，由染色質(zhì)聚縮而成的棒狀結(jié)構(gòu)。 實(shí)際上，兩者化學(xué)組成沒有差異，而包裝程度即構(gòu)型不同
這樣就相當(dāng)于拍了個照片，把基因組上分布的蛋白質(zhì)和各種修飾定格下來
然后，把交聯(lián)的染色質(zhì)進(jìn)行超聲裂解，一般破碎后的片段大小為200bp左右
note：
以上是采用交聯(lián)的ChIP-seq（X-ChIP），如果是N-ChIP則采用微球菌核酸酶裂解染色質(zhì)以獲取DNA片段（一般會得到147bp左右的片段），這種方案一般用于組蛋白修飾；但對于其他轉(zhuǎn)錄因子的研究，如果交聯(lián)方法使得抗原表位（就是抗原決定部位）被掩，不能被抗體識別，那么也可以使用N-ChIP去做；但真心不推薦使用N-ChIP去做轉(zhuǎn)錄因子的研究，因?yàn)樗鼈兒腿旧|(zhì)的結(jié)合比較松散，而N-ChIP的方法可能會破壞這本來就松散的聯(lián)系，丟失很多相關(guān)的DNA
抗原表位指抗原表面上決定抗原特異性的化學(xué)官能基。 抗原表位可被免疫系統(tǒng)（尤其是抗體、B細(xì)胞或者T細(xì)胞）識別。
免疫沉淀
接下來，與蛋白特異性結(jié)合的 或者 與感興趣的修飾部位特異結(jié)合的 抗體就出動了。用來識別蛋白-DNA復(fù)合物并帶它們出來（俗稱“拉下來”）。而這些抗體本身是帶有“標(biāo)簽”的（可以想象成：抗體一個頭有一個磁鐵N極，待他把蛋白-DNA復(fù)合物結(jié)合，完成任務(wù)后，總部使用另外的磁鐵S極把這個抗體連同復(fù)合物一起救走）【術(shù)語是：be pulled down and enriched using beads binding to the antibody】
救回來以后，要進(jìn)行清洗（去掉那些沒有特異性結(jié)合的），蛋白又被消化掉，剩下的DNA被收集純化起來，準(zhǔn)備建庫和測序
建庫
一般需要修補(bǔ)DNA的兩端、加上接頭，另外如果測序儀的一條lane需要測不同的樣本，那么還需要為DNA加上用于區(qū)分樣本的index 接頭（方便測序結(jié)束后將reads歸類）
該加的都加好后，進(jìn)行純化和PCR擴(kuò)增（保證測序上機(jī)濃度）。而擴(kuò)增這里就是眾所周知的引入偏差的一環(huán)，在保證上機(jī)濃度前提下，PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)應(yīng)該限制到越小越好。之后建好的文庫，就要加載到測序儀的玻璃載片（術(shù)語：flow cell，和顯微鏡的玻璃載片很像）進(jìn)行測序
測序
對DNA片段測序都是從5’測到3‘，接頭也分正反（forward and reverse兩種類型），它們也是隨機(jī)連接到雙鏈DNA片段上的；
單端測序：可以從forward或者reverse任一個接頭一端開始
雙端測序：從forward和reverse接頭同時開始
產(chǎn)生的測序讀長（read，測序就像讀書一樣一字一句，所以產(chǎn)出的數(shù)據(jù)是名詞read，翻譯為讀長）一般比文庫制備的DNA片段要短（從兩邊向中間測，不過也不排除有測通的情況）
總結(jié)
A圖就是實(shí)驗(yàn)步驟；B圖是之后會介紹的數(shù)據(jù)處理步驟
歡迎關(guān)注我們的公眾號～_～
我們是兩個農(nóng)轉(zhuǎn)生信的小碩，打造生信星球，想讓它成為一個不拽術(shù)語、通俗易懂的生信知識平臺。需要幫助或提出意見請后臺留言或發(fā)送郵件到jieandze1314@gmail.com
