最近，在紐約由哈佛醫(yī)學(xué)院和馬薩諸塞州總醫(yī)院研究員Keith Joung領(lǐng)導(dǎo)的一個(gè)國(guó)際研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種高度靈敏的方法，可以有力地識(shí)別CRISPR-Cas核酸酶在體內(nèi)的全基因組目標(biāo)效應(yīng)。
這項(xiàng)研究成果發(fā)表在《Nature》上，為促進(jìn)開(kāi)發(fā)使用基因編輯核酸酶的治療策略提供了藍(lán)圖。
研究人員描述了“體內(nèi)離體目標(biāo)的驗(yàn)證”，并演示了使用它和一種故意設(shè)計(jì)成雜亂無(wú)章的引導(dǎo)RNA即CRISPR-Cas核酸酶，在小鼠肝臟中誘發(fā)大量的非靶點(diǎn)突變。他們還利用VIVO實(shí)驗(yàn)證明，適當(dāng)設(shè)計(jì)的引導(dǎo)RNA可以在沒(méi)有檢測(cè)到非目標(biāo)突變的情況下有效地編輯小鼠體內(nèi)肝臟基因。
該研究思路包括初始的體外發(fā)現(xiàn)步驟，其中核酸酶的潛在非目標(biāo)切割位點(diǎn)的超集通過(guò)使用測(cè)序或CIRCLE-seq方法在體外報(bào)告切割效應(yīng)的循環(huán)來(lái)識(shí)別。第二步涉及體內(nèi)確認(rèn)，其中通過(guò)CIRCLE-seq鑒定的位點(diǎn)被檢測(cè)為已用核酸酶處理的目標(biāo)組織中的indel突變。
為了測(cè)試VIVO，研究人員設(shè)計(jì)了針對(duì)小鼠Pcsk9基因的化膿性鏈球菌Cas9引導(dǎo)RNA，他們預(yù)期該RNA在小鼠基因組中具有很高的誘導(dǎo)多重非目標(biāo)突變的可能性。在用這種混雜的gRNA-CRISPR復(fù)合物感染兩株小鼠后，研究人員用VIVO測(cè)定它在一株小鼠中造成3107個(gè)非靶切割位點(diǎn)，而在另一株小鼠中造成2663個(gè)非靶切割位點(diǎn)。
為了進(jìn)行VIVO的第二步，研究人員隨后評(píng)估他們鑒定的非目標(biāo)切割位點(diǎn)是否顯示小鼠肝臟體內(nèi)有吲哚類(lèi)化合物的證據(jù)。在他們檢查的45個(gè)位點(diǎn)中，有19個(gè)顯示了有吲哚類(lèi)化合物的顯著證據(jù)。這些數(shù)據(jù)向研究人員表明，Cas9與混雜的gRNA可在體內(nèi)產(chǎn)生穩(wěn)定或高頻率的非靶突變，并且即使它們以低頻出現(xiàn)，VIVO在識(shí)別這些非靶效應(yīng)方面也是有用的。
但是因?yàn)闈撛诘闹委煈?yīng)用不會(huì)使用混雜的gRNA，所以研究小組隨后試圖評(píng)估被設(shè)計(jì)為更具針對(duì)性的Cas9 gRNA的體內(nèi)非靶譜，因此他們構(gòu)建了另外兩個(gè)針對(duì)小鼠Pcsk9的gRNA。
他們?cè)俅问褂肰IVO來(lái)檢查非目標(biāo)效應(yīng)，但是這次在兩只小鼠中，在181個(gè)由CIRCLE-seq識(shí)別的潛在非目標(biāo)位點(diǎn)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)顯著的非目標(biāo)索引。為了進(jìn)一步排除CIRCLE-seq錯(cuò)過(guò)任何非目標(biāo)位點(diǎn)的可能性，研究人員還對(duì)在CIRCLE-seq實(shí)驗(yàn)中未被鑒定、在任何情況下未觀察到顯著指標(biāo)的小鼠基因組中最接近的位點(diǎn)進(jìn)行了有針對(duì)性的擴(kuò)增測(cè)序。
“據(jù)我們所知，我們的報(bào)告首次證明了CRISPR-Cas核酸酶在體內(nèi)可以強(qiáng)有力地誘導(dǎo)非靶點(diǎn)突變。先前的體內(nèi)研究報(bào)告沒(méi)有或很少有非靶點(diǎn)突變，但使用測(cè)序(GUIDE-seq)方法或硅膠方法中的其它方法實(shí)現(xiàn)的基于細(xì)胞基因組范圍的雙鏈斷裂無(wú)偏鑒定，這些方法尚未被證實(shí)可有效鑒定”作者寫(xiě)道。
相比之下，即使是那些突變頻率低至約0.13%的位點(diǎn)，VIVO也能夠在體內(nèi)對(duì)非靶位點(diǎn)進(jìn)行靈敏的鑒定。CIRCLE-seq的高靈敏度很可能是能夠識(shí)別所有潛在非靶位點(diǎn)的超集，包括那些在體內(nèi)實(shí)際突變的位點(diǎn)?！?/b>
參考資料：CRISPR Researchers Develop Highly Sensitive Method for Identification of Off-Target Effects In Vivo?| GenomeWeb（圖片引自文獻(xiàn)）
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