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了解什么是UMI，什么是barcode，再做分析之前，知道他們是在測(cè)序中引入，了解為什么引入即可。

看個(gè)簡(jiǎn)介的視頻吧

從了解10X genomics開始
陳巍學(xué)基因：http://www.iqiyi.com/w_19rvim699t.html，內(nèi)容大致如下：

10X 芯片測(cè)序

每一列孔對(duì)應(yīng)一個(gè)樣本
1：放樣本序列
2：放預(yù)制微珠（gel beads）
3：放油的（油包裹）
最上面：是在做好乳濁液后，回收乳濁液的孔

它可以做兩個(gè)事情：

第一件事情是可以做一群細(xì)胞當(dāng)中，每個(gè)單細(xì)胞的RNA表達(dá)情況的定量分析
第二件事情是可以做染色體的單倍體長(zhǎng)片段的組裝

解決問題：搞清楚數(shù)量較大的一群細(xì)胞，比如說幾千個(gè)細(xì)胞當(dāng)中每個(gè)細(xì)胞的mRNA表達(dá)分別有什么特征以及這些細(xì)胞按mRNA的表達(dá)特征來分，大致可以分成哪幾類。

微珠上引物的設(shè)計(jì)：

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每個(gè)凝膠微珠上，種上特定的DNA片段，分為幾段DNA序列

第一段序列：16nt的barcode，一共有400百萬種barcode，一個(gè)微珠對(duì)應(yīng)于一種barcode。通過這400百萬個(gè)barcode，可以吧凝膠為主給區(qū)分開。
第二段序列：UMI序列，“unique multiplex index”的簡(jiǎn)稱，是一段隨機(jī)序列，也就是說每一個(gè)DNA分子（后面會(huì)被oligodt pcr上于最后面），都有自己的UMI序列。10個(gè)堿基長(zhǎng)的UMI，有100萬種序列的變化（4的10次方=1048,,576）.作用：經(jīng)過PCR，在深度測(cè)序得到的reads，可以看出哪些reads是來自于一個(gè)原始的cDNA分子的，這樣就可以把起源于同一個(gè)cDNA分子的。因?yàn)镻CR擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生的多個(gè)reads，簡(jiǎn)并成一個(gè)原始的cDNA分子，也就是說可以排除各種cDNA，因?yàn)镻CR擴(kuò)增效率的不同而導(dǎo)致最后reads數(shù)量的偏差，也就是排除PCR bias。

可以這樣理解：barcode是每個(gè)凝膠微珠的身份證號(hào)碼；UMI是每個(gè)DNA標(biāo)簽分子的身份證號(hào)碼

UMI后面是ploy dt序列，作用：與mRNA的poly(A)尾巴結(jié)合，作為逆轉(zhuǎn)錄的引物，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA來

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細(xì)胞混懸液（第一個(gè)十字的箭頭進(jìn)入的就是細(xì)胞液）在第一個(gè)十字交叉口，與凝膠微珠（原始的離心管的就是凝膠微珠）混合到一起，然后進(jìn)入第二個(gè)十字交叉口，油相在這個(gè)十字交叉口加入進(jìn)來，油把凝膠微珠和細(xì)胞混懸液包裹成一個(gè)又一個(gè)的油包水的小液滴。這樣，小液滴里面是水相，外面是油相。

小微滴.png

白色圈圈就是細(xì)胞，其他顏色的就是微珠。有的小液滴包含細(xì)胞，有的包含兩個(gè)細(xì)胞（最下面的綠色凝珠），大部分的細(xì)胞會(huì)被分配到一個(gè)小液滴當(dāng)中。細(xì)胞混懸液中約65%的細(xì)胞，會(huì)被包到有微珠的小液滴當(dāng)中

做測(cè)序文庫(kù)

在得到乳濁液之后，接下來吧細(xì)胞膜破掉，讓細(xì)胞當(dāng)中的mRNA游離出來。

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也就是和逆轉(zhuǎn)錄酶、結(jié)合在凝膠微珠上的核酸引物、dNTP底物相接觸，接著發(fā)送逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，mRNA與凝膠微珠上帶標(biāo)簽的DNA分子相結(jié)合，逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA來。

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還會(huì)攜帶各自特定的UMI標(biāo)簽
有barcode和UMI序列：可以把這個(gè)cDNA分子就與其他的cDNA分子區(qū)分開。

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文庫(kù)

測(cè)序

一次測(cè)序幾百-幾千個(gè)細(xì)胞（可能現(xiàn)在更多個(gè)），barcode種類400萬種，所以大部分細(xì)胞，一個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)一個(gè)barcode。通過barcode拆分?jǐn)?shù)據(jù)，可以吧測(cè)序得到的reads歸屬到一個(gè)一個(gè)細(xì)胞。

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這種情況下，這幾個(gè)細(xì)胞的reads就混合成了一個(gè)pool，為減少pool形成，在做細(xì)胞混懸液的時(shí)候，就要控制原始的細(xì)胞數(shù)，經(jīng)驗(yàn)值是：一個(gè)樣本的細(xì)胞混懸液中細(xì)胞數(shù)控制在1W以下為好。

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原始reads越多，則被測(cè)到的基因數(shù)也會(huì)越多。

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也就是被讀到的基因數(shù)量的增加進(jìn)入平臺(tái)期。

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平均一個(gè)細(xì)胞的一個(gè)gene有10個(gè)左右的UMI，就可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，一個(gè)細(xì)胞一個(gè)基因表達(dá)量的多少，就是衡量這個(gè)細(xì)胞的一個(gè)維度，幾千個(gè)被測(cè)到的基因的表達(dá)量，也就是形成幾千個(gè)維度。