——by不是殺殺
Nature immunology
2021 May 20
IF:20.477
PMID:34017124
該文章基于原發(fā)性非小細胞肺癌和結(jié)直腸癌單細胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)CDS4+T細胞中有兩類細胞亞群在這兩種癌癥中具有高度相似的特征基因，之后進一步通過流式細胞技術(shù)對scRNA-seq的分析結(jié)果進行蛋白質(zhì)層面上的驗證，并在多種不同腫瘤、癌癥不同階段以及轉(zhuǎn)移性腫瘤中對這類細胞亞群進行觀察，發(fā)現(xiàn)這類細胞與癌癥的進展相關(guān)，并且能夠抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答。
背景
在免疫系統(tǒng)中CD4+T淋巴細胞可以協(xié)助B細胞和CD8+T細胞，并協(xié)調(diào)抗腫瘤免疫應(yīng)答。CD4+調(diào)節(jié)性T細胞（CD4+ Treg）可以通過抑制自身反應(yīng)性T細胞來抑制免疫應(yīng)答，維持組織穩(wěn)態(tài)，同樣這個特點也能夠被腫瘤細胞利用，促進腫瘤的生長，因此CD4+ Treg浸潤腫瘤往往與不良的預(yù)后相關(guān)。經(jīng)典CD4+ Treg的特點是表達轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白 P3 (FOXP3)[FOXP3+ CD4+ Treg]。
此外，幾項研究表明FOXP3- CD4+ Treg，通常稱為1型調(diào)節(jié)T細胞（Tr1）能夠基于細胞毒性和產(chǎn)生白介素10（IL-10）來抑制免疫應(yīng)答。目前研究表明FOXP3- Tr1細胞可能能夠調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)，但對于這類細胞的分子特征和臨床關(guān)聯(lián)是未知的。
方法
結(jié)果
1.
在非小細胞肺癌（NSCLC）和結(jié)直腸癌（CRC）的單細胞轉(zhuǎn)錄組測序中，對CD4+ T細胞進行降維聚類，分別定義了9個和11個細胞亞群，通過差異表達分析得到每個細胞亞群的差異基因，選取在不同腫瘤間具有保守性的特征基因作為每個亞群的名稱。通過秩篇重疊度量（一種用來描述排序列表相似性的度量方法）來比較NSCLC和CRC中CD4+ T細胞亞群之間差異表達基因的相似性。從圖中可以看出CRC中類3和NSCLC中的類3以及CRC中類4和NSCLC中類6具有高度的相似性。
進一步分析發(fā)現(xiàn)CRC和NSCLC中類3差異表達FOXP3、MAGH1、TIGIT、OX10以及IL2RA等典型腫瘤浸潤性 Treg細胞的分子特征。在CRC類4和NSCLC類6中發(fā)現(xiàn)其差異表達EOMES和GZMK等。
為明確定義這兩個細胞亞群是否是FOXP3+和EOMES+細胞群，進行了基因集富集分析（GSEA），使用的參考基因集為先前研究中基于大量RNA-seq得到的CD4+ FOXP3+及CD4+ EOMES+細胞的特征基因，富集分析結(jié)果表明這兩類細胞與先前鑒定的CD4+ FOXP3+和CD4+ EOMES+細胞具有高度相似的分子藍圖。此外單細胞轉(zhuǎn)錄組分析表明GZMK在識別出的EOMES+亞群中表達顯著上調(diào)。
小結(jié)：上訴工作確定了具有潛在抑制功能且在不同腫瘤中顯示出高度相似性的兩類細胞。
2.
為在蛋白質(zhì)水平驗證單細胞轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果，對48個非小細胞肺癌樣本和28個結(jié)直腸癌樣本進行流式細胞分析，分析結(jié)果表明EOMES陽性細胞大部分會表達GZMK，但GZMK陽性細胞僅有小部分表達EOMES。同時實驗表明，GZMK陽性細胞缺乏CNLY、CD25、FOXP3等蛋白的表達，而這些蛋白是Treg細胞的特征。
GZMK+細胞表達CCR5及PD1，這些是產(chǎn)生IL-10的效應(yīng)T細胞的標志物。結(jié)果還指出，相比于GZMK- EOMES-細胞，僅有GZMK+ EOMES+細胞產(chǎn)生干擾素γ（INF-γ）和白介素10。
從新鮮的腫瘤組織中純化EOMES+ Tr1樣細胞，與CD4+T細胞以不同比例混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制CD4+T細胞的增殖，且抑制程度與傳統(tǒng)的FOXP3+ Treg細胞相當。同時EOMES+ Tr1樣和FOXP3+ Treg細胞都能夠抑制CD8+T的增殖。
小結(jié)：研究定義了一種腫瘤浸潤中CD4+ EOMES+ Tr1樣細胞亞群，該細胞亞群以GZMK的表達、白介素10的產(chǎn)生以及能夠有效抑制T細胞增殖為特征。
3.
使用流式細胞技術(shù)從腫瘤組織、癌旁組織、外周血中分離CD4+T細胞，可以看出EOMES+ Tr1樣細胞在腫瘤組織顯著增加，且表明腫瘤浸潤性EOMES+ Tr1樣細胞與腫瘤進展之間存在關(guān)聯(lián)性。
從結(jié)直腸癌伴肝同步轉(zhuǎn)移腫瘤scRNA-seq數(shù)據(jù)中同樣能夠識別出這兩類細胞亞群，通過GSEA可知這兩類細胞與原發(fā)性腫瘤中的兩類細胞高度相似。
在其他癌癥數(shù)據(jù)的分析中，同樣能夠鑒定出這兩類細胞，并與之前識別出的這兩類細胞具有一樣的分子藍圖，說明這兩類細胞在不同癌癥中高度富集，具有保守性。
小結(jié)：這些發(fā)現(xiàn)表明EOMES+ Tr1樣細胞和FOXP3+Treg細胞在不同的腫瘤類型和轉(zhuǎn)移灶中都高度富集，表明他們都有助于抑制原發(fā)和轉(zhuǎn)移部位的免疫應(yīng)答。
4.
結(jié)合TCR譜分析，發(fā)現(xiàn)EOMES+ Tr1樣細胞具有最高的克隆擴增指數(shù)（圖a）；在結(jié)直腸癌的3個樣本中均顯示出擴增的EOMES+ Tr1樣細胞，一半以上EOMES+ Tr1樣細胞具有共享的TCR克隆型（圖b）。此外，EOMES+ Tr1樣細胞與FOXP3+Treg細胞之間的克隆共享情況表明這兩類細胞具有獨立的起源（圖c）。圖b中Morista重疊指數(shù)實現(xiàn)了TCR克隆重疊的定量測量（每個點代表一個細胞亞群，大的大小表示細胞數(shù)量的多少，線的粗細表明共享TCR的數(shù)量多少），發(fā)現(xiàn)EOMES+ Tr1樣細胞與多個細胞亞群具有較多的TCR克隆共享，這暗示EOMES+ Tr1樣細胞可能由某種CD4+T細胞終末分化而來。
選出與EOMES+ Tr1樣細胞具有最多TCR克隆共享的細胞亞群，進行GSEA鑒定，發(fā)現(xiàn)它們與1型輔助T細胞（TH1）具有相似的分子藍圖，此外，體外實驗表明在IL-4條件下通過CD3刺激僅有TH1細胞誘導(dǎo)上調(diào)了EOMES基因的表達。
小結(jié)：這些數(shù)據(jù)表明EOMES+ Tr1樣細胞可能是來源于腫瘤微環(huán)境中1型輔助T細胞的終末分化細胞。
5.
為評估EOMES+ Tr1樣細胞對預(yù)后的影響，需要尋找一種可以在所有細胞類型中識別出這類細胞的分子標志物（由于EOMES在CD8+ 細胞中也有表達，因此不能用它作為直接標志物）。分析發(fā)現(xiàn)CHI3L2基因在EOMES+ Tr1樣細胞中顯著差異上調(diào)，該基因表達一種分泌蛋白，這種蛋白在細胞中具有生長因子活性。
將樣本分為CHI3L2高表達和低表達組，生存分析表明CHI3L2高表達的樣本具有較差的預(yù)后。但有趣的是，通過PD1抑制劑治療后的樣本中，CHI3L2高表達組表現(xiàn)出了更好的生存，且體外實驗表明EOMES+ Tr1樣細胞抑制CD8+T細胞增值的能力在PD1抑制劑存在的情況下降低，表明其與對抗程序性細胞死亡蛋白 1 (PD1) 的反應(yīng)相關(guān)，極有可能成為癌癥免疫治療的新靶點。
