文獻(xiàn)：通過(guò)RNP-MaP確定RNA與蛋白質(zhì)作用的核心功能區(qū)域的方法來(lái)分析RNA-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

發(fā)表時(shí)間：2021年3月

BACKGROUND

作者

Kevin M. Weeks |? ?University of North Carolina

生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，研究領(lǐng)域是RNA的結(jié)構(gòu)與功能，RNA治療。

研究方向主要有兩個(gè)：①通過(guò)化學(xué)原理，高分辨率地研究RNA空間結(jié)構(gòu)及其功能。

②用如上技術(shù)研究以RNA為基礎(chǔ)的生物系統(tǒng)的作用、功能以及其疾病機(jī)理。

實(shí)驗(yàn)室研究領(lǐng)域和方向

General Idea

概述

文章發(fā)表了一種新的研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的方法——RNP-MaP，應(yīng)用于U1核糖核蛋白、RNase P和RMRP蛋白、XIST長(zhǎng)非編碼RNA結(jié)合蛋白這三種蛋白質(zhì)，與其相結(jié)合的RNA的相互作用關(guān)系，從而證明了RNP-MaP是一種高效的方法。

DETAILS

1)Mechanism——RNP-MaP strategy

RNP-MaP機(jī)制的概述

? ? ? ? 運(yùn)用一種可以進(jìn)入細(xì)胞的化合物NHS-diazirine (SDA)對(duì)蛋白質(zhì)及其在RNA上的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行交聯(lián)。具體原理如下：

? ? ? ? SDA有兩個(gè)反應(yīng)區(qū)域，一個(gè)亞氨基，可以與氨基酸（主要是賴氨酸）反應(yīng)形成氨鍵；另一個(gè)反應(yīng)區(qū)域是雙吖丙啶，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)波紫外照射后形成卡賓或重氮化合物，攻擊核苷酸。交聯(lián)條件：氨基距離4A以內(nèi)，賴氨酸約8A。

? ? ? ? 將SDA加入細(xì)胞培養(yǎng)基，SDA進(jìn)入細(xì)胞與蛋白質(zhì)交聯(lián)，用紫外光照射，產(chǎn)生卡賓或重氮化合物并與RNA相應(yīng)位點(diǎn)交聯(lián)。將細(xì)胞裂解并消化蛋白質(zhì)，得到交聯(lián)多肽加合物的RNA鏈。將RNA反轉(zhuǎn)錄，cDNA測(cè)序，數(shù)據(jù)分析后可以得到突變標(biāo)記的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)以及蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)。

證明SDA+UV+細(xì)胞內(nèi)的必要性

? ? ? ? 在缺失SDA或缺失UV light照射或細(xì)胞外的條件下測(cè)試該方法，發(fā)現(xiàn)SDA+UV+細(xì)胞內(nèi)都是實(shí)驗(yàn)成功的必要條件。

2) Experiment 1：U1 small nuclear ribonucleoprotein

3) Experiment 2：conserved interaction network in RNase P and RMRP RNAs

be continued......

REFERENCE

[1] Weidmann, C.A., Mustoe, A.M., Jariwala, P.B.?et al.?Analysis of RNA–protein networks with RNP-MaP defines functional hubs on RNA.?Nat Biotechnol?39,?347–356 (2021).

[2]?https://chem.unc.edu/faculty/weeks-kevin/