title: 綜述-The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation
date: 2019-11-16 12:00:00
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• 文獻筆記

前言

這篇文獻是邵峰于2019年11月發(fā)表在《Nature Reviews Immunology》上的綜述，對gasdermin的最近研究做了總結(jié)，對天然免疫有興趣的同學(xué)可以讀一讀。

注：由于gasdermin沒有相應(yīng)的中文譯名，我個人覺得可以譯為“焦孔素”比較好。

文獻信息

Broz, P., et al. (2019). "The gasdermins, a protein family executing cell death and inflammation." Nature Reviews Immunology.

文獻摘要

gasdermins是最近鑒定出來的一個具有成孔效應(yīng)蛋白家族，這個家族的能造成膜通透性(permeabilization)與細(xì)胞焦亡(pyroptosis)，細(xì)胞焦亡是一種裂解性的，炎癥性的細(xì)胞死亡形式。gasdermins含有一個細(xì)胞毒性的N末端結(jié)構(gòu)域和一個C末端的抑制結(jié)構(gòu)域，它們通過一 個柔性構(gòu)件連接。這兩個結(jié)構(gòu)域之間的連接蛋白水解后，就會解除細(xì)胞毒性結(jié)構(gòu)域的分子內(nèi)抑制作用，使N末端結(jié)構(gòu)域插入到細(xì)胞膜中，形成大寡聚孔，從而破壞細(xì)胞的離子穩(wěn)態(tài)并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。gasdermins誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在許多遺傳病、自身炎癥性疾病和癌癥中扮演著重要的角色。篇綜述討論了gasdermin最新的研究進展，重點涉及gasdermin活化、孔形成和gasdermin誘導(dǎo)的膜通透化。

相關(guān)術(shù)語

1. inflammasome（炎癥小體）：一種多蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，當(dāng)檢測到宿主來源或病原體來源的危險信號時，炎癥小體就會在細(xì)胞質(zhì)開始組裝，促進細(xì)胞因子的釋放，細(xì)胞的焦亡型死亡以及炎癥。
2. caspases（半胱天冬氨酸蛋白酶）：半胱氨酸依賴性天冬氨酸蛋白酶家族，它作用于底物上特定的天冬氨酸殘基，這個家族的酶在細(xì)胞死亡和炎癥中發(fā)揮著核心功能。
3. necrosis（壞死）：細(xì)胞死亡方式之一，細(xì)胞經(jīng)歷這種死亡形式時，細(xì)胞膜喪失完整性，釋放細(xì)胞成分。
4. NLRP3：英文全稱是Nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat and pyrin domain- containing 3，即核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域，富含亮氨酸重復(fù)序列和含Pyrin結(jié)構(gòu)域3，這是組裝炎癥小體的細(xì)胞質(zhì)感受器。NLRP3是一個廣譜感受器，它能識別病原體相關(guān)和損傷相關(guān)分子模式。
5. Pannexin-1 channels（膜聯(lián)蛋白-1通道）：一種細(xì)胞膜通道，可以通透離子和小分子代謝物，例如ATP。
6. NETosis：中性粒細(xì)胞的一種特殊死亡方式，其特征是釋放DNA，組蛋白和顆粒內(nèi)容物到細(xì)胞外空間。
7. Liposomes（脂質(zhì)體）：由磷脂組成的，含有至少一個脂質(zhì)雙層的人造球形囊泡。
8. Mitophagy（線粒體自噬）：在營養(yǎng)饑餓或線粒體應(yīng)激的情況下，通過自噬選擇性地去除線粒體。
9. ASC foci（ASC焦點），英文全稱為apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain foci，即含有caspase募集結(jié)構(gòu)域焦點的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白，這是一個多聚體蛋白，由炎癥小體蛋白的同源寡聚引發(fā)的螺旋原纖維形成。
10. Familial Mediterranean fever（家族性地中海熱）：一種常染色體隱性遺傳性自身炎癥疾病，由MEFV基因突變引起，該蛋白編碼蛋白Pyrin，疾病的特征是自限性發(fā)熱和漿膜炎(Serositis)。
11. Pyrin：由細(xì)菌誘導(dǎo)的RHO修飾和肌動蛋白細(xì)胞骨架動力學(xué)破壞的炎癥小體形成的細(xì)胞質(zhì)感受器。由MEFV基因編碼。
12. Peroxisomes（過氧化物酶體）：真核細(xì)胞的過氧化物酶體細(xì)胞器參與不同脂肪酸的分解代謝和活性氧的減少。
13. NLRP1：英文全稱為(Nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat and pyrin domain- containing 1，即核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域，富含亮氨酸重復(fù)序列和含1個Pyrin結(jié)構(gòu)域，這是一個細(xì)胞質(zhì)感受器，組裝成炎癥小體。它通過N末端規(guī)蛋白酶體降解途徑(N-end rule proteosomal degradation pathway)活化。
14. NLRC4：英文全稱為Nucleotide-binding oligomerization domain, leucine-rich repeat and caspase recruitment domain-containing 4，即核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域，富含亮氨酸重復(fù)序列和含caspase募集結(jié)構(gòu)域-4，一種炎癥小體支架蛋白(scaffold protein)，與炎癥小體感受器(NLR家族凋亡抑制蛋白(NAIP))結(jié)合時寡聚化，并形成活化caspase 1的平臺。
15. Toll樣受體：位于內(nèi)體和細(xì)胞膜上的一類模式識別受體，識別病原體相關(guān)和損傷相關(guān)的分子模式，并啟動信號通路以誘導(dǎo)炎癥。

前言

gasdermin基因家族最早于20世紀(jì)初報道，該家族的基因當(dāng)時是作為小鼠皮膚突變的候選基因來進行研究的。gasdermin這個名稱是基于gasdermin A(GSDMA) 蛋白只表達在小鼠的腸道(gastrointestinal tract )和皮膚上皮細(xì)胞(epithelium of the skin)中。早期的研究還發(fā)現(xiàn)，gasdermin與DFNA5（deafness autosomal dominant non-syndromic sensorineural 5）的N末端區(qū)域的序列非常相似，DFNA5這個蛋白于1998年發(fā)現(xiàn)，它與人類的非綜合征型常染色體顯性遺傳性有關(guān)。基于這種同源特性，一些其它的gasdermin家族的成員以及gasdermin樣蛋白也被陸續(xù)鑒定出來了，目前在人類中有6個同源基因( paralogous genes)，即GSDMA，GSDMB，GSDMA，GSDMD，GSDME（也被稱為DFNA5）和PJVK（也被稱為DFNB59）（Fig.1a)。

gasdermin家成員是基于序列同源進行鑒定的，它們表示出不同的組織表達特征（Box 1與Table 1）。但是在過去的15年里，這些蛋白的精確功能卻并不清楚。盡管如此，在這些蛋白被鑒定后不久，人們就發(fā)現(xiàn)了這些蛋白與細(xì)胞活力和炎癥之間存在著某些聯(lián)系。例如在小鼠方面，Gsdama3（編碼小鼠的GSDMA3蛋白）的9種突變體與小鼠的脫毛有關(guān)，并伴隨著明顯的干細(xì)胞耗竭，角化過度(hyperkeratosis)以及炎癥。另一方面，敲除Gsdma3基因后，小鼠并不表現(xiàn)出肉眼可見的皮膚表型，這說明，Gsdma3基因的突變體增加了某些功能。表明gasdermins潛在細(xì)胞毒性的最直接證據(jù)的研究指出，使用某些突變的，C末端截短式的人源GSDME能夠?qū)е陆湍讣?xì)胞的細(xì)胞周期停滯，以及人類細(xì)胞（凋亡型）的死亡。不過，gasdermins是否是細(xì)胞死亡程序體(cell death programme)的組成部分，以及這些蛋白控制的細(xì)胞死亡類型仍然不清楚。

2015年，兩項獨立的研究揭示了gasdermin功能的機制，隨后不久，第三項研究證實了gasdermin的作用機制。這些研究表明，GSDMD是焦亡的唯一執(zhí)行者(BOX 2)。自從這一發(fā)現(xiàn)以來，大量的文獻開始描述gasdermins在炎癥生物學(xué)、細(xì)胞死亡等方面的作用。在這篇綜述中，我們討論了對gasdermin激活和調(diào)節(jié)、gasdermin孔隙的組裝和gasdermin蛋白家族相關(guān)的生物學(xué)功能的最新進展。

Fig.1：gasdermin家族

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Fig1:gasdermin蛋白家族。

A. 系統(tǒng)發(fā)育樹顯示了人，小鼠和大鼠gasdermin(GSDM)家族蛋白的差異。人gasdermin蛋白(GSDM)家族由6個基因編碼，其總序列相似性范圍為23.9~49.4%。這些家族可以被進一步細(xì)分，因為GSDME和pejvakin(PJVK)也屬于耳聾相關(guān)基因(DFN)，這兩類蛋白質(zhì)序列聚在一起，遠(yuǎn)離其他人類gasdermins(GSDMA-GSDMD)。從進化角度來講，GSDME和PJVK是最古老的gasdermin成員，在低等脊椎動物和一些無脊椎動物中也發(fā)現(xiàn)了相似的序列，但在蠕蟲和蒼蠅中沒有發(fā)現(xiàn)。GSDMA基因序列存在于哺乳動物以及鳥類和爬行動物中，而GSDMB、GSDMC和GSDMD基因僅存在于哺乳動物基因組中，并且與GSDMA密切相關(guān)，這表明它們是通過基因復(fù)制產(chǎn)生的。小鼠和大鼠缺乏GSDMB，但除了Gsdmd，Gsdme和Pjvk外，小鼠還具有三個GSDMA同源物(Gsdma1-Gsdma3)和四個GSDMC同源物(Gsdmc1-Gsdmc4)。從結(jié)構(gòu)上講，gasdermins由兩個不同的結(jié)構(gòu)域組成，通過一個柔性連接區(qū)連接，除了PJVK呈現(xiàn)出一個較小的C-末端結(jié)構(gòu)域(CT)。N末端gasdermin(GSDM NT)結(jié)構(gòu)域在所有家族成員中顯示出最高的序列相似性(相似性范圍為28.8%至50.5%)。相比之下，C-末端gasdermin(GSDM CT)結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)可變長度和較低的相似性(范圍從1.3%到46.3%)。GSDM NT具有固有的成孔/誘導(dǎo)焦亡活性，而GSDM CT與GSDM NT相互作用，從而在沒有活化信號的情況下抑制其活性。標(biāo)度表示序列中每個氨基酸的替換次數(shù)。上述系統(tǒng)發(fā)育樹由歐洲生物信息學(xué)研究所(EMBL-EBI)Clustal Omega tool 從UniProt序列生成的，并由Figtree軟件版本1.4.3繪制。**

B. 人GSDMD和GSDME的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，其特征在于連接區(qū)中的caspase裂解序列(頂部)和膜插入的N-末端結(jié)構(gòu)域(NT；底部)。

Box1：gasdermins的鑒定和表達模式

• gasdermin A(GSDMA；也稱為GSDM，GSDM1或FKSG9)首先從小鼠皮膚中克隆發(fā)現(xiàn)，其表達主要局限于人的食管、膀胱和皮膚的上皮細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞也能表達出可檢測到的GSDMA蛋白。小鼠Gsdma1、Gsdma2和Gsdma3的表達也僅限于上皮和皮膚，包括表皮、毛囊和胃。
• GSDMB(也稱為GSDML，PP4052或PRO2521)是通過使用GSDMA序列作為誘餌進行數(shù)據(jù)庫同源性搜索發(fā)現(xiàn)的。GSDMB是gasdermin家族中最具分散特征的成員(另見圖1a)，它不存在于小鼠和大鼠基因組中，盡管一些嚙齒動物物種具有GSDMB同源的序列。GSDMB的表達主要在氣道上皮，食道，胃，肝臟，小腸和結(jié)腸等組織中也檢測到。已經(jīng)在人類中檢測到不同的GSDMB剪接可變體，其中一個轉(zhuǎn)錄本編碼為GSDMB，在域間連接區(qū)(interdomainlinker)(由外顯子6編碼)中具有caspase 1裂解位點。過表達實驗表明，caspase 1可以切割這種異構(gòu)體并誘導(dǎo)裂解性細(xì)胞死亡。
• GSDMC(也稱為MLZE)首先被鑒定為在轉(zhuǎn)移性小鼠黑色素瘤細(xì)胞中表達上調(diào)的基因，后來被鑒定為gasdermin家族的成員。小鼠基因組包含四個Gsdmc同源基因。GSDMC的表達僅限于食管、皮膚、脾臟和陰道。人工截短的N端GSDMC(GSDMC NT)能夠誘導(dǎo)焦亡，但是什么信號可以激活GSDMC以及如何激活GSDMC仍然不清楚。
• GSDMD(也稱為GSDMDC1，DFNA5L或FKSG10)首先通過在人類基因組數(shù)據(jù)庫中搜索GSDMA的同源物而鑒定出來的。GSDMD在不同的人類組織以及白細(xì)胞的不同亞群中廣泛表達。GSDMD直系同源基因僅存在于哺乳動物基因組中，并且都包含一個大的中央結(jié)構(gòu)域，具有caspase 1和小鼠caspase 11或人caspase 4和5的切割位點。然而，值得注意的是，在較低等的脊椎動物，例如斑馬魚中，caspase a(caspy)或caspase b(Caspy2)是人類caspase 1和人類caspase 4或5的同源物，據(jù)報道它們能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并參與免疫。這表明GSDMD的功能同源物可能存在于這些低等脊椎動物中，盡管不能排除存在其他替代的細(xì)胞死亡途徑。在哺乳動物中，caspase 1切割前體pro-IL-1β，產(chǎn)生成熟的有生物活性的IL-1β細(xì)胞因子。同時，由caspase1、小鼠caspase11或人caspase4或5切割GSDMD導(dǎo)致形成高度裂解的GSDMD NT蛋白片段，其允許釋放成熟的IL-1β(Fig. 2)。IL-1β的低級脊椎動物序列缺少保守的caspase 1切割位點，但是，盡管如此，魚類caspase a，caspase b或IL-1β的抑制在感染期間對宿主是有害的。Gsdmd和pro-IL-1β在哺乳動物中都具有caspase 1切割位點，因此可以賦予炎癥小體對IL-1β信號傳導(dǎo)的兩個關(guān)鍵步驟的調(diào)控，即其加工和釋放。相比之下，這兩個步驟可能由低等脊椎動物中的同源蛋白酶(如caspase a或caspase b)和GSDMD同源物控制。
• GSDME(也稱為ICERE-1或DFNA5)最初被克隆為常染色體顯性非綜合征性聽力損失的候選基因，后來被發(fā)現(xiàn)與gasdermins具有序列和結(jié)構(gòu)上的相似性。GSDME在不同的人類細(xì)胞和組織中有不同的表達，包括腦、子宮內(nèi)膜、胎盤和腸等。在小鼠和人類中，GSDME由caspase 3加工，它直接誘導(dǎo)或在細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)后間接誘導(dǎo)焦亡。
  GSDME在不同種類的低等脊椎動物中也有表達，例如，GSDME的兩個同源基因(GsdmEa和GsdmEb)可以在硬骨魚(bony fish)中找到。Caspase 3切割位點在斑馬魚GsdmEa中存在，但在GsdmEb中不存在，這表明GsdmEa可以被認(rèn)為是GSDME的功能同源物。目前尚不清楚GsdmEb是否由魚類Caspy或caspy2加工，但如果是這樣，GsdmEb可能作為哺乳動物GSDMD的功能同源物(見上文)。有趣的是，斑馬魚中GsdmEb的缺失會導(dǎo)致耳朵的半規(guī)管畸形，這表明GsdmEb可能導(dǎo)致與人類GSDME相關(guān)的聽力損失。
• Pejvakin(PJVK；也稱為DFNB59或GSDMF)是另一種與耳聾相關(guān)的突變蛋白，但最初是從人類睪丸中克隆得到的。PJVK與GSDME高度相似，PJVK同源基因存在于早期脊椎動物和無脊椎動物中，這表明gasdermin蛋白家族可能是從這些祖先進化而來的。PJVK在睪丸中表達較高，但在其他組織中也廣泛表達，包括內(nèi)耳的毛細(xì)胞和聽覺系統(tǒng)的其他細(xì)胞(TABLE 1)。到目前為止，還不清楚PJVK是否能夠被蛋白酶處理，以及它的N末端或全長PJVK是否形成膜孔。

Fig.2：gasdermin D的經(jīng)典和非經(jīng)典炎性小體活化

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Fig. 2。gasdermin D在經(jīng)典和非經(jīng)典的炎癥小體活化方面的作用。
A. 模式識別受體例如pyrin，AIM2，NAIP-NLRC4，NLRP3和NLRP1產(chǎn)生信號后，炎癥小體復(fù)合物就會組裝起來。這識別受體能識別PAMP，內(nèi)源性危險信號或細(xì)胞死亡，損傷或感染引起的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)改變。
這些受體通過同型或異型PYD/CARD(caspase活化和招募結(jié)構(gòu)域)相互作用來招募含有caspase募集結(jié)構(gòu)域(ASC)的銜接蛋白凋亡相關(guān)speck樣蛋白的，從而進一步招募pro-caspase 1或直接招募pro-caspase 1。caspase 1在炎癥小體中被活化，并且caspase 1加工gasdermin D(GSDMD)以及pro-IL-1β和pro-IL-18等細(xì)胞因子。當(dāng)細(xì)胞膜被GSDMD孔通透化時，細(xì)胞經(jīng)歷溶裂解、促炎性細(xì)胞死亡（焦亡），促進成熟的IL-1β和IL-18的釋放。在沒有細(xì)胞裂解的情況下，GSDMD孔還可以直接釋放細(xì)胞因子，如IL-1α，危險分子，如高遷移率族蛋白-1(HMGB1)，甚至包括caspase 1在內(nèi)的整個炎癥復(fù)合物。

B. 非經(jīng)典的炎癥小體通路會導(dǎo)致小鼠caspase 11的活化（人類則是caspase 4和caspase 5）。來自革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)結(jié)合并誘導(dǎo)這些caspase的寡聚化和活化，使它們能夠切割GSDMD。在第一步中，GSDMD孔允許鉀釋放，導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的活化和IL-1β/IL-18的成熟。在第二個步驟中，GSDMD孔導(dǎo)致焦亡，從而驅(qū)動成熟細(xì)胞因子的釋放。由GSDMD孔引起的膜損傷通過運輸(ESCRT)機制所需的內(nèi)體分選復(fù)合體進行修復(fù)。

NAIP, NLR family apoptosis inhibitory protein; NLR , nucleotide- binding oligomerization domain, leucine- rich repeat- containing protein; NLRC4, NLR with CARD domain- containing 4; NLRP1/3, NLR with pyrin domain- containing 1/3.

TABLE 1:gasdermin表達譜

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gasdermin活化

在20世紀(jì)80年代和90年代，焦亡被認(rèn)為是由毒素刺激或病原體感染誘導(dǎo)，并導(dǎo)致巨噬細(xì)胞由caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞死亡形式。后來的研究表明，促炎caspases（這是在炎癥復(fù)合體中活化的一組proteases）的主要效應(yīng)機制就是焦亡。炎癥小體的活化有兩種不同的途徑，即經(jīng)典炎癥途徑和非經(jīng)典炎癥途徑，它們能識別病原體來源或宿主來源的危險信號，并開啟人源caspase 1和caspase 4的活化或鼠源caspase 11的活化。這些caspases能夠在GSDMD的中央連接區(qū)（人類中的是FLTD，小鼠中的是LLSD）切割GSDMD(Fig. 1b)，產(chǎn)生兩個片段，一個是31kDa 的N末端GSDMD NT片段，該片段有著內(nèi)在的成孔活性，另外一個是22kDa的C末端GSDMD CT片段，它能與GSDMD NT結(jié)合，作為抑制后者的抑制劑。GSDMD NT本身的表達就能誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，而GSDMD CT的過表達則會阻止細(xì)胞死亡。

這些結(jié)果就構(gòu)建了一個caspase介導(dǎo)的GSDMD切割的模型，切割后生成的GSDMD NT從GSDMD CT的抑制中釋放出來（也就是說，GSDMD NT與膜磷脂的結(jié)合后，分子內(nèi)的相互作用就會很容易破壞細(xì)胞膜），因此誘導(dǎo)細(xì)胞的焦亡。其它的一些發(fā)現(xiàn)也支持了這個模型，gasdermin家族的成員多數(shù)都含有類似的結(jié)構(gòu)（除了PJVK，pejvakin含有一個截短的C末端結(jié)構(gòu)域），也就是說含有一個N末端細(xì)胞毒性結(jié)構(gòu)域和一個C末端抑制結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域由一個構(gòu)件連接，異位表達GSDMA，GSDMB，GSDMC或GSDME的N末端結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)會誘導(dǎo)壞死(necrosis)，這種形式的細(xì)胞死亡在形態(tài)類似于GSDMD誘導(dǎo)的焦亡。因此，gasdermin家族作為一組新的細(xì)胞死亡效應(yīng)因子就被發(fā)現(xiàn)了，這些效應(yīng)因子由其能誘導(dǎo)N末端焦亡的形式來發(fā)揮作用。

GSDMD中含有caspase 1切割位點，而在其它的gasdermins成員中，除了GSDMB的一個較小的剪接突變體外，其余的成員并不含有這個位點，不過它們可能含有其它的protease切割的位點。事實上，人源和鼠源GSDME的連接區(qū)(Fig. 1b)含有一個caspase 3剪切基序(motif)，另外有研究指出，當(dāng)受到凋亡刺激后，活化的caspase 3會在這個位點切割GSDME(Fig. 3)。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，有人指出，當(dāng)細(xì)胞已經(jīng)以進入凋亡程序后，GSDME會導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)焦亡，喪失膜完整性。后來的研究則不同意該假設(shè)，并表明，盡管有些細(xì)胞在自然條件下含有高水平的GSDME，并表現(xiàn)出一些凋亡的特征，但是GSDME也還能直接誘導(dǎo)焦亡；另外還發(fā)現(xiàn)，Gsdme缺陷的巨噬細(xì)胞仍能通過某些未知程序，出現(xiàn)二級壞死(secondary necrosis)，進入凋亡程序。有意思的是，GSDME不是唯一在凋亡誘導(dǎo)后被活化的gasdermin成員。使用藥物誘導(dǎo)或病原體誘導(dǎo)的激酶TAK1或抑制凋亡(IAP)，能夠誘導(dǎo)GSDMD的切割，并且這一過程并不依賴于caspase 1和caspase 11。有人指出，在這種條件下，GSDMD直接由caspase 8切割(Fig. 3)，這與caspase 8可以在體外加工GSDMD的事實是相符的，盡管這一過程比較慢。也有人認(rèn)為，由caspase 8驅(qū)動的GSDMD孔隙形成過程是造成凋亡細(xì)胞鉀外流和NLRP3炎性小體活化的原因，但其它的發(fā)現(xiàn)指出，這一過程是由 pannexin-1通道活化的caspase驅(qū)動介導(dǎo)的。有意思的是，凋亡細(xì)胞中的GSDMD的活性受到caspase 3的負(fù)調(diào)控，caspase 3通過切割GSDMS的N末端結(jié)構(gòu)域來發(fā)揮作用，進而產(chǎn)生失活片段。caspase 8活化GSDMD的生理功能和caspase 3的負(fù)調(diào)控作用還有待進一步確定。然而現(xiàn)在已經(jīng)明確，GSDMD可以在“調(diào)亡”刺激后造成裂解性細(xì)胞死亡和炎癥。

現(xiàn)在人們認(rèn)識到，導(dǎo)致gasdermin活化的通路已經(jīng)擴展到了caspase家族之外。兩項研究表明，在活化的中性粒細(xì)胞中，細(xì)胞中的彈性蛋白酶(elastase)能切割GSDMD，這是一種絲氨酸蛋白酶，它對中性粒細(xì)胞的成熟和抗菌功能非常重要。雖然彈性蛋白酶在炎性caspases作用基序的上游幾個位點處切割GSDMD，但是這種切割仍然能產(chǎn)生功能性孔形成片段。GSDMD在中性粒細(xì)胞中的精確機制現(xiàn)在仍然有爭議。已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，Gsdmd缺陷的小鼠對大腸桿菌更有抵抗性，這可能是由于中性粒細(xì)胞的壽命延長所致。另一方面，有人認(rèn)為，GSDMD與中性粒細(xì)胞的死亡（注：原文中使用的術(shù)語是NeTosis，這是一種中性粒細(xì)胞的死亡方式）的有關(guān)。因此，GSDMD在中性細(xì)胞中同時發(fā)揮著好壞雙重作用，這要取決于感染的類型以及是否需要中性粒細(xì)胞存活或死亡來限制病原體。

雖然誘導(dǎo)gasdermins活化的唯一已知生理機制就是蛋白水解，但是有幾條證據(jù)表明，移除C末端gasdermin(GSDM CT)結(jié)構(gòu)域并不是gasdermin活化的絕對條件。某些突變會導(dǎo)致自身抑制性結(jié)構(gòu)域的相互作用被破壞，從而觸發(fā)gasdermin的活化，這表明，C末端結(jié)構(gòu)域本身的存在并不會干預(yù)孔的形成。GSDMA3的晶體結(jié)構(gòu)揭示了結(jié)構(gòu)域間相互作用的關(guān)鍵特征是GSDMA3 NT的α1螺旋和β1-β2發(fā)夾環(huán)，它們深入GSDMA3 CT的疏水核的凹槽里。GSDMA，GSDMA3，GSDMC，GSDMD和GSDME的C-末端結(jié)構(gòu)域的疏水核心突變都會導(dǎo)致焦亡，并且導(dǎo)致脫毛的Gsdma3突變體的幾個映射到C-末端結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域間相互作用界面。因此，生理信號通路有可能通過解除自身抑制，例如通過磷酸化或其他翻譯后修飾，以類似的方式誘導(dǎo)gasdermin的活化。

Fig. 3：gasdermin被凋亡型caspase誘導(dǎo)的活化

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Fig. 3 “凋亡型”caspases誘導(dǎo)gasdermins的活化。

某些外部刺激，例如腫瘤壞死因子(TNF)或Toll樣受體3和4的配體(TLR3和TLR4)，都能抑制凋亡抑制因子(IAP)蛋白，第二線粒體來源的胱氨酸酶活化劑(second mitochondria-derived activator of caspase,SMAC)模擬化合物或病原體誘導(dǎo)的TAK1激酶抑制可以促進激酶受體相互作用蛋白1(RIP1)依賴的胞質(zhì)caspase 8激活復(fù)合物(復(fù)合物IIb/壞死性凋亡小體(Ripoptosome))的組裝?；钚詂aspase 8通過活化效應(yīng)性caspase，如caspase 3來驅(qū)動細(xì)胞凋亡，但也切割gasdermin D(GSDMD)以產(chǎn)生活性N-末端片段?；钚訥SDMD可以誘導(dǎo)孔形成，但僅局限在天冬氨酸D87(小鼠D88)處受到caspase 3依賴的切割，從而產(chǎn)生GSDMD的非活性p20/p10片段。然而，caspase 3也可以切割和激活GSDME，從而在GSDME高表達的細(xì)胞中將細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)化為焦化。GSDME誘導(dǎo)的焦亡不同于繼發(fā)性壞死，繼發(fā)性壞死以GSDMD/GSDME非依賴性方式進行。

FADD, Fas associated via death domain; SMAC, second mitochondrial- derived activator of caspases; TNFR1, tumour necrosis factor receptor 1; TRAM, TRIF- related adaptor molecule; TRIF, TIR domain-containing adapter- inducing IFNβ.

gasdermin的孔形成機制

焦亡的特征在于由gasdermin孔形成，進而引起的細(xì)胞膜破裂。體外結(jié)合試驗表明，gasdermin N末端可以直接與膜脂相互作用。有研究報道，GSDMD NT優(yōu)先靶向作用于酸性磷脂，例如磷脂酰肌醇和心磷脂，但也可以弱結(jié)合到磷脂酸和磷脂酰絲氨酸上。 其它的gasdermins例如GSDME，GSDMA和鼠源GSDMA3的N末端結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出類似的脂質(zhì)結(jié)合特性，這表明整個gasdermin家族具有共同的膜靶向機制。磷脂酰肌醇僅存在于細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)小葉中。與此一致的是，N末端gasdermin(GSDM NT)結(jié)構(gòu)域只能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的焦亡，在細(xì)胞外添加活化的gasdermin并不會造成細(xì)胞的膜裂解。心磷脂具有類似于磷酸肌醇的帶負(fù)電荷的頭部結(jié)構(gòu)，它們存在于真核生物和細(xì)菌的線粒體內(nèi)膜中。在大腸桿菌中表達GSDM NT結(jié)構(gòu)域會表現(xiàn)出嚴(yán)重的毒性，重組GSDM NT蛋白可以裂解巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的原生質(zhì)體。已經(jīng)有研究表明，GSDMA3 NT和GSDMD NT單獨或當(dāng)不受分子內(nèi)抑制時可以破壞線粒體，并且當(dāng)細(xì)菌暴露于重組的GSDMD NT時，細(xì)菌的生成會受到抑制，不過還有待進一步的研究才能確定gasdermin的成孔結(jié)構(gòu)域是如何進入內(nèi)膜的。除了磷脂能夠與GSDM NT結(jié)構(gòu)域發(fā)生強烈的相互作用外，至于其它的膜脂結(jié)構(gòu)，即使它們沒有表現(xiàn)出與GSDM NT的特異性和強烈的結(jié)合，也有GSDM NT結(jié)構(gòu)域通過影響膜的物理特性來發(fā)揮作用。例如，鞘磷脂的存在可以極大地促進GSDMD NT與脂質(zhì)體的結(jié)合，而將膽固醇包在脂膜中則顯著降低了與GSDMD NT的結(jié)合。雖然對于大多數(shù)gasdermins來說，只能用游離的GSDM NT結(jié)構(gòu)域觀察到脂質(zhì)結(jié)合，但全長GSDMB則表現(xiàn)出與單獨的GSDMB NT結(jié)構(gòu)域類似的脂質(zhì)結(jié)合能力，這表明GSDMB CT結(jié)構(gòu)域不妨礙GSDMB的脂質(zhì)結(jié)合功能。 除了磷酸肌醇結(jié)合外，GSDMB還與硫脂能特異結(jié)合，但這種結(jié)合的生理相關(guān)性仍有待確定。

考慮到所有GSDM NT結(jié)構(gòu)域之間序列的高度相似性，因此可以推測出大多數(shù)（有可能不是全部）gasdermins使用類似的機制在膜中形成孔(Fig. 4)。全長GSDMA3的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)和最近鑒定的從重組脂質(zhì)體(liposomes)中提取的GSDMA3 NT孔洞的低溫電鏡結(jié)構(gòu)提供了一個很好的模板，讓人們詳細(xì)地來理解gasdermin形成的孔洞。在GSDMA3晶體結(jié)構(gòu)中，GSDMA3 NT結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出延伸的扭曲β片狀結(jié)構(gòu)，兩側(cè)有幾個螺旋，這代表了一種在已知的成孔蛋白中未發(fā)現(xiàn)的新的球狀折疊。

從β片的一端延伸出一個長環(huán)，連接到緊密并列在GSDM NT結(jié)構(gòu)域一側(cè)的螺旋GSDM CT結(jié)構(gòu)域。在GSDM NT結(jié)構(gòu)域內(nèi)，螺旋α1和位于β片層結(jié)構(gòu)凹側(cè)的短β發(fā)夾與GSDM CT結(jié)構(gòu)域具有密切的相互作用。在β片層的另一端，由兩個柔性環(huán)持有的短螺旋從球狀褶皺中突出，它們與GSDM CT結(jié)構(gòu)域的另一部分相互作用(Fig. 4)。兩個結(jié)構(gòu)域間的相互作用將全長GSDMA3鎖定到自抑制狀態(tài)。當(dāng)自抑制被破壞時，GSDM CT結(jié)構(gòu)域從凹面釋放，解除對GSDM NT的抑制，而GSDM NT結(jié)構(gòu)域則以形成膜孔。

與自抑制狀態(tài)相比，孔內(nèi)的GSDMA4 NT結(jié)構(gòu)顯示出構(gòu)象發(fā)生了強烈的變化，這種變化主要存在于兩個結(jié)構(gòu)元件中。在自抑制結(jié)構(gòu)中與GSDM CT結(jié)構(gòu)域接觸的短螺旋連同其側(cè)翼環(huán)一起重新折疊成兩條β鏈，形成一個β發(fā)夾。在鄰近區(qū)域，另一條β鏈及其側(cè)翼環(huán)也重新折疊成β鏈，并形成一個額外的β發(fā)夾。四個新形成的β鏈各自與核心β片層結(jié)構(gòu)中的現(xiàn)有β鏈合并。兩個反向平等的β發(fā)夾形成了一個長的四鏈雙親性β片層結(jié)構(gòu)，這個結(jié)構(gòu)從gasdermin N末端結(jié)構(gòu)域的核心球狀折疊延伸中伸出去。

這些構(gòu)象變化會產(chǎn)生三個寡聚界面，驅(qū)動GSDM NT結(jié)構(gòu)域形成環(huán)狀孔結(jié)構(gòu)，并伴隨著兩親性β片層結(jié)構(gòu)綁定在一起，組裝成一個插入膜中的β桶結(jié)構(gòu)。β桶或寡聚界面上的突變，例如GSDMD中的E15K和L192D突變會嚴(yán)重操作GSDM NT結(jié)構(gòu)域的成孔活性。每個GSDMA3孔包含大約26-28個GSDM NT原聚體(promoters)，不過多數(shù)都是27倍原聚體(Fig. 4)。GSDMA3孔的內(nèi)徑約為18 nm，外徑約為28nm。GSDMD孔的并不均一，它們的內(nèi)徑在10到20 nm之間，這表明由不同GSDM NT結(jié)構(gòu)域形成的孔中存在著環(huán)境依賴的化學(xué)計量。GSDMD孔的尺寸足夠大，這樣在經(jīng)典炎癥小體中活化過程中生成的成熟的IL-1β就能流出來。

導(dǎo)致孔形成的構(gòu)象變化是由GSDM NT結(jié)構(gòu)域與膜磷脂的結(jié)合觸發(fā)的。在GSDMA3孔的低溫電子顯微鏡結(jié)構(gòu)中觀察到了可能的脂質(zhì)結(jié)合位點。在螺旋α1和插入膜的β片層之間的根部和帶正電荷的口袋中電子密集，心磷脂的頭部基團中也有類似的電子密度，也被用于重建GSDMA3孔。該口袋的表面被自抑制GSDMA3結(jié)構(gòu)中的GSDM CT域完全掩蔽。由于結(jié)構(gòu)域間切割不能解鎖自抑制相互作用(GSDMD和GSDME)，因此仍有待研究帶電的磷脂頭如何能夠進入完全掩埋的口袋從而觸發(fā)隨后的構(gòu)象變化?；蛘哒f，在GSDM NT結(jié)構(gòu)域中可能存在另一個脂質(zhì)結(jié)合位點，該位點具有與膜中磷脂完全結(jié)合的啟動作用。在GSDMA3孔中觀察到的結(jié)構(gòu)變化使人想起膜攻擊復(fù)合體穿孔素樣/膽固醇依賴性細(xì)胞溶解素(MACPF/CDC)家族中所觀察到的結(jié)構(gòu)變化，盡管兩種類型的孔形成蛋白的總體結(jié)構(gòu)非常不同。對于MACPF/CDC家族來說，單體成孔結(jié)構(gòu)域在隨后的構(gòu)象變化之前寡聚成可溶性的前孔結(jié)構(gòu)(pre-pore)，從而介導(dǎo)膜插入和成熟孔的形成。利用高分辨率原子力顯微鏡，最近的一項研究分析了GSDMD孔隙形成的動態(tài)過程，研究發(fā)現(xiàn)GSDMD NT單體嵌入脂細(xì)胞膜并組裝成弧形或狹縫狀中間寡聚物，然后生長為環(huán)狀跨膜孔(Fig. 4)。該過程是連續(xù)的，并且不涉及前孔結(jié)構(gòu)的過渡階段，這不同于MACPF/CDC家族的特征。

Fig.4：gasdermin膜的插入和孔形成機制

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Fig. 4 gasdermin膜插入和孔形成的機制。N-末端gasdermin(GSDM NT)和C-末端gasdermin(GSDM CT)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用使蛋白質(zhì)保持在自抑制狀態(tài)。在GSDMNT結(jié)構(gòu)域內(nèi)，螺旋α1和位于β片層結(jié)構(gòu)凹側(cè)的短β-發(fā)夾與GSDM CT結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生緊密的相互作用。此外，從β片層的一端延伸出一個長環(huán)路與GSDM CT連接。一旦自身抑制被破壞，通過哺乳動物caspase 1，小鼠caspase 11或人caspase 4/5和GSDME切割gasdermin D(GSDMD)的機制，GSDM CT從凹面釋放，從而釋放GSDM NT，后者用于膜插入和孔形成。膜靶向需要具有帶負(fù)電荷頭部基團的磷脂，就如在細(xì)胞膜的內(nèi)葉上發(fā)現(xiàn)的那樣。與自抑制狀態(tài)相比，GSDM NT的孔構(gòu)象顯示出劇烈的構(gòu)象變化，這涉及到新的β鏈與扭曲的β片層結(jié)構(gòu)合并的重新折疊。這些變化還會產(chǎn)生新的寡聚界面，驅(qū)動跨膜的β桶，即GSDM NT孔的組裝。從結(jié)構(gòu)角度來看，gasdermin可以在沒有結(jié)構(gòu)域間切割的情況下通過破壞分子內(nèi)抑制的機制來活化。

gasdermin孔形成后的結(jié)果

在細(xì)胞膜上形成的gasdermin孔通常會導(dǎo)致由于孔誘導(dǎo)的膜裂解而導(dǎo)致的細(xì)胞壞死?？紤]到不同的信號和細(xì)胞環(huán)境，不同細(xì)胞或不同細(xì)胞群體的gasdermin孔的數(shù)量和大小可能不同，這就導(dǎo)致了不同的細(xì)胞死亡依賴或細(xì)胞死亡無關(guān)的細(xì)胞效應(yīng)。

亞溶解孔形成

雖然在實驗體系中，gasdermin孔最終會導(dǎo)致焦亡，但是細(xì)胞裂解并非總是這些孔的主要功能。到目前為止，這種“非依賴裂解”的功能僅在GSDMD孔方面提到，不過其它gasdermin家族的成員也有可能有類似的機制。例如，研究表明，GSDMD孔的形成可能由于細(xì)胞類型，GSDMD表達水平，活化和時間以及對抗機制的效率而有所不同。例如在小鼠巨噬細(xì)胞中，用細(xì)菌肽聚糖的N-乙酰氨基葡萄糖片段或OxPAPC能誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的活化，即在沒有出現(xiàn)細(xì)胞裂解的情況下，還是會出現(xiàn)GSDMD依賴的活細(xì)胞中IL-1β的釋放。類似的，在炎性小體活化時，LPS能誘導(dǎo)人單核細(xì)胞釋放IL-1，以及誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞非裂解形式(lysis-independent)的IL-1釋放。這些研究表明不僅表明了會出現(xiàn)亞裂解形式的GSDMD孔的形成，并且亞裂解形式的GSDMD孔也許是一種直接的，非常規(guī)形式的釋放的IL-1β和IL-18的釋放途徑，從而可以使在細(xì)胞不發(fā)生裂解時能釋放這兩種細(xì)胞因子。

gasdermin孔的這種非溶解依賴的功能或許也有可能釋放其它蛋白質(zhì)或參與信號通路的調(diào)控。GSDMD相對較大尺寸的孔可以直接釋放IL-1β和IL-18（這些細(xì)胞因子的分子直徑約為5nm）以及其它小的胞質(zhì)蛋白，例如小GTP酶，半乳糖凝集素或半胱氨酸內(nèi)肽酶抑制劑cystatins。此外，由于gasdermin孔是大的、非選擇性的膜通道，由gasdermin孔引起的離子流出甚至在細(xì)胞死亡之前就可以對細(xì)胞信號通路產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。例如，由GSDMD孔引起的鉀流出在LPS誘導(dǎo)的非典型炎癥途徑活化后觸發(fā)NLRP3的活化。由于鉀驅(qū)動的NLRP3活化是一種細(xì)胞內(nèi)在機制，因此鉀外流和NLRP3活化必定在細(xì)胞經(jīng)歷GSDMD驅(qū)動的焦亡之前發(fā)生。類似地，有人提出，在嗜肺軍團菌以亞裂解形式活化AIM2炎性小體后，GSDMD依賴的鉀流出活化NLRP3，并且鉀流出損害IFN-I應(yīng)答，而與最終細(xì)胞的死亡無關(guān)。

那么，細(xì)胞是如何調(diào)節(jié)gasdermin的活化或孔形成的水平，以及膜上孔形成的過程是可逆的么？干擾素調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子IRF2能強烈上調(diào)GSDMD的表達，這可能使處于休眠狀態(tài)的細(xì)胞保持低水平的GSDMD，從而避免細(xì)胞死亡。此外，不同細(xì)胞類型和活化觸發(fā)器之間的caspase的活性有很大差異，這也可能是導(dǎo)致亞裂解型GSDMD活化的條件。此外，對成孔毒素或機械或激光誘導(dǎo)的膜損傷的研究表明，細(xì)胞膜損傷不是一個最終事件，并確定了幾種類型的膜修復(fù)機制，它們可以在幾秒鐘或幾分鐘內(nèi)恢復(fù)膜的完整性。參與修復(fù)機制的一些蛋白被招募到細(xì)胞膜上，從而對Ca2+通過GSDMD孔的內(nèi)流產(chǎn)生應(yīng)答，并促進含有受損膜的囊泡的出芽以及釋放。在中性粒細(xì)胞或亞裂解型炎性小體活化過程中，ESCRT或其它的膜修復(fù)系統(tǒng)是否活躍還需要進一步的證明。

需要注意的是，ESCRT或其它膜出芽機制釋放的囊泡可能代表了非常規(guī)的蛋白質(zhì)分泌的替代途徑。在早期關(guān)于炎性小體活化的研究發(fā)現(xiàn)，在炎性小體活化后不久，外泌體脫落增加，并且可以在炎性小體活化的細(xì)胞外泌體中發(fā)現(xiàn)成熟的IL-1β。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，類似的外泌體形成與外泌體介導(dǎo)的IL-1β的釋放依賴于GSDMD。這些囊泡是否能以非特異性的試釋放胞質(zhì)蛋白或IL-1β和其它蛋白質(zhì)是否優(yōu)先包裝到這些囊泡中還有待進一步的研究。總體而言，根據(jù)GSDMD的活化水平，gasdermin孔作為非常規(guī)蛋白分泌的主要調(diào)節(jié)器，通過直接膜轉(zhuǎn)位(孔功能)、囊泡釋放(誘導(dǎo)膜修復(fù))或通過膜裂解的被動釋放(焦亡)來促進無導(dǎo)(leaderless)蛋白的釋放。

焦亡型細(xì)胞死亡

在大多數(shù)情況下，GSDMD加工水平和GSDMD孔形成的增加最終將克服調(diào)節(jié)機制并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。這種由炎癥caspase的活化控制的特定類型的導(dǎo)致細(xì)胞壞死的開啟類型最初被稱為焦亡；然而，由于所有的GSDM NT結(jié)構(gòu)域都可以在沒有caspase活化的情況下誘導(dǎo)焦亡，因此術(shù)語“焦亡”已經(jīng)被重新定義為一種以gasdermin依賴型的細(xì)胞死亡形式(Box 2)。在細(xì)胞培養(yǎng)中，焦亡細(xì)胞的特征是廣泛的胞膜空泡化，隨后膜膨脹，最終膜完整性喪失，這可能是由于滲透溶解導(dǎo)致的。導(dǎo)致細(xì)胞裂解的精確事件尚不完全清楚，可能gasdermin在細(xì)胞器膜，例如線粒體或核膜上形成了孔，這一事件有助于誘導(dǎo)細(xì)胞死亡以及導(dǎo)致焦亡細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)上的改變。例如，GSDMD NT與心臟脂質(zhì)結(jié)合，并被發(fā)現(xiàn)它線粒體膜為靶點，并且能增強活性氧的生成。GSDMA3 NT也能夠損傷線粒體并誘導(dǎo)線粒體自噬。在中性粒細(xì)胞中，GSDMD已被證明能與核膜結(jié)合并破壞它，從而在NETosis期間促進DNA的分泌。因此，即使在高效的細(xì)胞膜修復(fù)的條件下，影響細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的gasdermin孔仍可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

體內(nèi)的焦亡型細(xì)胞死亡證據(jù)源于對于自身炎癥冷卟啉相關(guān)周期性綜合征(CAPS)患者的研究，研究發(fā)現(xiàn)，在患者的炎癥爆發(fā)時，能在患者的血液中系統(tǒng)地檢測到炎癥寡聚體，這表明潛在的細(xì)胞焦亡伴隨著活化的炎癥小體。從冷卟啉相關(guān)周期性綜合征患者體內(nèi)分離單核細(xì)胞，使用炎癥小體激動劑來刺激該細(xì)胞，就能發(fā)現(xiàn)一小部分細(xì)胞表現(xiàn)出炎癥小體標(biāo)記物的陽性結(jié)果，這說明，并非所有的單核細(xì)胞都會出現(xiàn)焦亡。由GSDMD驅(qū)動的焦亡也被證明能夠影響冷卟啉相關(guān)周期性綜合征的小鼠模型的疾病嚴(yán)重程度。至于焦亡在體內(nèi)參與疾病以及宿主防御的功能方面，還需要更多的研究。

焦亡通常指的是一種炎癥形式的細(xì)胞死亡，發(fā)生焦亡的細(xì)胞釋放出大量的分子，這些分子能發(fā)生“找我”的信號，并且呈遞“吃我“的信號，例如磷脂酰絲氨酸。因此，可以推斷，通過胞吐(efferocytosis)作用可以有效地除去焦亡細(xì)胞的殘留物。然而，焦亡形式的細(xì)胞死亡與壞死形式的細(xì)胞死亡不同，在多數(shù)情況下，焦亡是由炎癥caspases引發(fā)的，因此焦亡的過程伴隨著IL-1β和其它IL-1家族成員的釋放。這些細(xì)胞因子的釋放有可能是導(dǎo)致GSDMD依賴性的焦亡表型，并使其與壞死區(qū)分開來。但是，現(xiàn)在不能排除焦亡的細(xì)胞也能釋放其它獨特的危險信號分子，這些信號分子是在細(xì)胞器破裂或caspase活性的過程產(chǎn)生的。一些研究已經(jīng)鑒定了與焦亡相關(guān)的分泌組(secretome)，鑒定了在caspase 1活化和細(xì)胞膜通透人時時釋放的900多個蛋白質(zhì)。然而，目前還沒有系統(tǒng)的研究將焦亡的分泌組和免疫學(xué)結(jié)果與其他類型的細(xì)胞死亡進行比較?？傊?，現(xiàn)在可以假設(shè)焦亡能導(dǎo)致不同的免疫學(xué)結(jié)果，導(dǎo)致低水平或高水平的炎癥反應(yīng)(Fig. 5)，并且這種炎癥應(yīng)答將取決于活化的gasdermin的類型，活化的機制(蛋白酶驅(qū)動或其他驅(qū)動)，執(zhí)行焦亡的細(xì)胞環(huán)境和細(xì)胞類型，以及gasdermin損傷介導(dǎo)的膜修復(fù)效率。

Fig.5：gasdermin孔形成以及焦亡的免疫學(xué)結(jié)果

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Fig. 5 gasdermin孔隙形成和焦亡的免疫學(xué)結(jié)果。焦亡細(xì)胞釋放大量細(xì)胞內(nèi)分子，這些分子可以通過充當(dāng)警報器和“找到我”信號來活化免疫系統(tǒng)。
A. 如果gasdermin孔被修改并終止了gasdermin活化信號，那么細(xì)胞內(nèi)容物的釋放可能是短暫的，并且僅限于能夠穿過gsdermin孔的小分子(損傷相關(guān)的分子模式(DAMP))。
B. 在病原體或激活NF-κB的損傷相關(guān)信號存在的情況下，核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域、富含亮氨酸重復(fù)和含Pyrin結(jié)構(gòu)域的3(NLRP3)炎癥小體就會活化焦亡，并與caspase 1的活化和促炎細(xì)胞因子(IL-1β，IL-18)的釋放以及穿過gasdermin毛孔的小細(xì)胞內(nèi)蛋白(DAMP)有關(guān)。在這種情況下，如果沒有修復(fù)細(xì)胞膜上的gasdermin孔，則隨著促炎細(xì)胞因子釋放的激增，以及大量細(xì)胞內(nèi)成分(如炎癥小體寡聚體)的釋放，最終會以導(dǎo)致促炎性焦亡。因此，焦亡最有可能導(dǎo)致不同的免疫學(xué)結(jié)果，導(dǎo)致低水平或高水平的炎癥反應(yīng)。

GSDMD, gasdermin D; PAMP, pathogen- associated molecular pattern.

Box 2：焦亡：一種由gasdermin誘導(dǎo)的壞死型細(xì)胞死亡

焦亡這個術(shù)語最初是根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征和對caspase 1的嚴(yán)格而特異性的要求而定義的，它被定義為“caspase 1依賴性壞死”。焦亡這個詞的英文是pyroptosis，它最初來源于希臘語，其中pyro的意思是“火”或者“發(fā)熱”，ptosis的意思是“落”（注：這里的“落”可以理解為樹葉落下這個動作，跟凋亡的英語apoptosis中的后綴ptosis一樣），這兩個部分構(gòu)成了pyroptosis，意思是強調(diào)這種細(xì)胞死亡形式的特征是伴隨著促炎發(fā)生以及成熟的IL-1β和IL-18的釋放。隨后在2002年鑒定了炎癥小體復(fù)合物，以及在2011年發(fā)現(xiàn)了非典型炎癥小體通路，焦亡又被重新定義為炎癥小體依賴性細(xì)胞死亡以及炎性小體的效應(yīng)機制。然而，現(xiàn)在的研究也明確發(fā)現(xiàn)，焦亡并不一定伴隨著成熟的IL-1β和IL-18的釋放，因為即使在沒有caspase 1的情況下，小鼠caspase 11和人caspase 4誘導(dǎo)的具有所有特征的形態(tài)學(xué)特征也會誘發(fā)焦亡。這一點通過鑒定GSDMD作為焦亡的唯一執(zhí)行者而進一步得確認(rèn)。并且實驗表明，GSDMD或其他gasdermins的N-末端結(jié)構(gòu)域的表達足以誘導(dǎo)焦亡，而不需要caspase的活化。

更多的報道已經(jīng)開始從炎癥caspase和炎性小體中研究焦亡和gasdermin活化。例如，研究表明，中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和caspase 8可以切割和激活GSDMD以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，并且caspase 3加工GSDME也可以導(dǎo)致焦亡型細(xì)胞死亡。由于在所有情況下，細(xì)胞死亡在形態(tài)上類似于焦亡，并且依賴于gasdermin家族成員的活化，因此似乎很明顯，焦亡這個術(shù)語需要重新定義。因此，我們建議將“焦亡”定義為“gasdermin誘導(dǎo)的壞死型細(xì)胞死亡”，并將此術(shù)語應(yīng)用于所有可通過誘導(dǎo)膜通透化而導(dǎo)致細(xì)胞死亡的gasdermin家族成員。我們建議可以將這個術(shù)語獨立地使用于涉及了gasdermin激活的實際機制和它發(fā)生的細(xì)胞類型中(We also suggest to use this term independently of the actual mechanism of gasdermin activation and the cell type in which it occurs.)。我們承認(rèn)上游信號事件或受影響的細(xì)胞類型可以改變焦亡刺激炎癥或免疫反應(yīng)的能力（由caspase 1引起的焦亡涉及成熟的IL-1β的釋放，而GSDME依賴的焦亡可能不會），這與活化機制有關(guān)，與作為細(xì)胞死亡執(zhí)行者的gasdermins的功能無關(guān)。

gasdermins在疾病方面的作用

在不同的病理生理條件下，gasdermin家族發(fā)揮著重要的，以及各種功能的焦亡作用，因此gasdermin家族可能在機體的健康和疾病中發(fā)揮了重要作用。事實上，事實上，第一個gasdermin基因就是因為其在小鼠皮膚病中的作用才被克隆出來的。隨著2015年首次發(fā)生gasdermin在焦亡和炎癥小體活化中的作用，現(xiàn)在已經(jīng)涌現(xiàn)了很多研究gasdermin活化與各種疾病關(guān)系的文獻。

gasdermin A

GSDMA的在胃腸道和皮膚中高表達，但在原發(fā)性胃癌和胃癌細(xì)胞系中不表達。早期的研究表明，恢復(fù)人胃癌細(xì)胞系中的GSDMA表達可以增加其對轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。然而，GSDMA在癌細(xì)胞中的促死亡活性是否需要切割以及GSDMA在健康胃上皮細(xì)胞中的生理功能尚不清楚。如上所述，GSDMA3 NT在培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達后，它會通過細(xì)胞膜通透化(permeabilization)來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。有趣的是，在這一過程中，還存在LC3-II的上調(diào)，這是自噬途徑的標(biāo)記，這表明GSDMA3誘導(dǎo)的自噬可能與自噬成分的活化同時發(fā)生，但其潛在機制以及GSDMA3 NT誘導(dǎo)自噬的生理相關(guān)性仍有待確定。GSDMA3 NT誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡可以通過共表達GSDMA3 CT而被抑制，這一現(xiàn)象類似于該結(jié)構(gòu)域在其他gasdermins中發(fā)現(xiàn)的抑制功能。Gsdma3的不同突變體與皮膚相關(guān)表型相關(guān)，其中就包括角質(zhì)形成和脫發(fā)。然而，Gsdma3-/-小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的皮膚發(fā)育異常，這表明這些突變賦予了突變體蛋白新的功能。皮膚中Gsdma3的生理功能似乎與毛發(fā)的發(fā)育有關(guān)。Gsdma3中的功能獲得突變(gain-of-function)被發(fā)現(xiàn)能破壞GSDMA3的自身抑制，從而使GSDMA3 NT結(jié)構(gòu)域誘導(dǎo)焦亡。在過表達GSDMA3 NT的細(xì)胞中能觀察到線粒體活性的下降。然而，目前尚不清楚GSDMA3 NT和/或GSDMA3的功能獲得突變是否可以直接靶向作用于線粒體膜并形成孔，從而導(dǎo)致線粒體衰竭并促進線粒體自噬和焦亡。

gasdermin B

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)GSDMB與腫瘤進展有關(guān)，其在胃癌、宮頸癌和乳腺癌以及肝癌中的表達上升。在人類表皮生長因子受體2(HER2；也稱為ERBB2)陽性的乳腺癌患者中，腫瘤細(xì)胞中GSDMB基因表達增加與預(yù)后不良、生存率降低和轉(zhuǎn)移增加有關(guān)，也與HER2靶向治療的不良治療反應(yīng)有關(guān)；同時，GSDMB被發(fā)現(xiàn)與ERBB2有共表達。GSDMB在人類中有幾種剪接體，GSDMB異構(gòu)體2(isoform)與乳腺癌細(xì)胞中的促瘤性(pro-tumorigenic)和促轉(zhuǎn)移性表型(pro-metastatic)密切相關(guān)。目前尚不清楚GSDMB如何促進癌細(xì)胞存活的，因為GSDMB NT在培養(yǎng)的細(xì)胞中過度表達時能夠誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

不同的全基因組關(guān)聯(lián)研究也揭示了某些GSDMB單核苷酸多態(tài)性與疾病易感性增加之間存在著相關(guān)性，如哮喘、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis)。全長GSDMB和GSDMB NT結(jié)構(gòu)域都可以與磷脂酰肌醇和巰基糖脂硫脂結(jié)合。事實上，GSDMB也被認(rèn)為在硫脂的細(xì)胞運輸方面發(fā)揮作用，研究表明GSDMB CT內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性可以導(dǎo)致GSDMB結(jié)構(gòu)的改變，從而影響細(xì)胞內(nèi)的硫脂水平。他研究發(fā)現(xiàn)，GSDMB的剪接異構(gòu)體(splice variant)與哮喘風(fēng)險較低有關(guān)。這個異構(gòu)體缺少編碼caspase 1裂解位點的外顯子，因此影響GSDMB誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞的焦亡能力。要充分了解GSDMB在癌癥、感染和自身免疫性疾病中的作用還需要進一步的深入研究。

gasdermin C

GSDMC最初被發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞中高表達，因此最初被命名為黑素瘤衍生亮氨酸拉鏈額外核因子(MLZE)。最近有報道稱，GSDMC敲除后能降低結(jié)直腸癌細(xì)胞系的增殖，這為GSDMC的促腫瘤作用提供了進一步的證據(jù)。然而，另一項研究表明，GSDMC在許多食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達受到抑制，這表明它可能是腫瘤抑制基因。因此，到目前為止還沒有關(guān)于GSDMC是否促進或抑制癌癥發(fā)展，以及這一功能是否需要其N-末端成孔結(jié)構(gòu)域活化的研究報道。

gasdermin D

體外研究表明，GSDMD是非典型炎癥途徑下游細(xì)胞死亡的唯一執(zhí)行者。然而，值得注意的是，由于存在ASC焦點刺激的備用細(xì)胞死亡程序或更混雜有caspase 1的蛋白水解活性，因此GSDMD的缺失并不能完全消除經(jīng)典炎癥小體活化后的細(xì)胞死亡。在活體實驗方面，研究表明Gsdmd-/-小鼠與Casp11-/-小鼠一樣，對LPS誘導(dǎo)的致死性具有類似的保護作用。此外，Casp11-/-和Gsdmd-/-小鼠腸沙門氏菌亞種(Salmonella enterica subsp)或腸血清鼠傷寒沙門氏菌(TyphimuriumΔSifa)和流產(chǎn)布魯氏菌(Brucella Abortus)的感染均表現(xiàn)出易感性增強，這兩類細(xì)菌都能活化非經(jīng)典炎癥小體通路。相比之下，在感染新兇手弗朗西絲氏菌(Francisella novicida)方面，Gsdmd-/-小鼠比CASP1-/-或AIM2-/-小鼠抵抗力更強。同樣，據(jù)報道，感染鼠傷寒沙門氏菌(S. Typhimurium)的gsdmd-/-小鼠的腹腔IL-1β水平高于casp1-/-casp11-/-小鼠。然而，Gsdmd缺乏癥完全保護了攜帶有Pyrin家族性地中海熱(familial Mediterranean fever)相關(guān)的Mefv V276A等基因的小鼠免受自身炎癥疾病的發(fā)展，并且在表達有NLRP3的D301N功能獲得突變的小鼠中完全消除了所有新生兒期發(fā)病多系統(tǒng)炎性疾病(neonatal onse multisystem inflammatory disease,NOMID)相關(guān)的炎癥癥狀。因此，GSDMD可能在體內(nèi)發(fā)揮環(huán)境依賴性作用，并且在某些情況下，Gsdmd-/-動物可能參與替代的細(xì)胞死亡途徑，從而允許保護動物免受典型炎癥小體活化后的微生物攻擊。

gasdermin E

GSDME最初報道為與人類非綜合征性聽力損失相關(guān)的基因。所有已知的GSDME突變跳過了外顯子8，從而產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的截短蛋白。由于GSDME NT具有重組后活性和跳過外顯子8導(dǎo)致GSDME CT阻遏結(jié)構(gòu)域的破壞，因此可以假設(shè)GSDME相關(guān)的聽力損失是由細(xì)胞死亡引起的。然而，由于GSDME在多個組織中表達，目前尚不清楚為什么內(nèi)耳細(xì)胞在GSDME自動活化時優(yōu)先經(jīng)歷細(xì)胞死亡。一種合理的解釋是，由于移碼突變，從而導(dǎo)致了編碼與聽力有關(guān)的某個蛋白的尾部出現(xiàn)了41個殘基的非自然序列，使得正常的蛋白被截短，而這個截短的蛋白對蛋白酶體的降低非常敏感；因此，該蛋白的剩余低水平僅足以損害聽覺系統(tǒng)?；蛘哒f，GSDME的不同表達水平和不同細(xì)胞類型中截短的突變體的降解途徑存在差異，這都有可能導(dǎo)致一些細(xì)胞對耳聾突變更具抵抗力。

GSDME的生理活化機制可能涉及caspase 3的切割。激活caspase 3的化療藥物，如拓?fù)涮婵?topotecan)、依托泊苷(etoposide)、順鉑(cisplatin)和CPT-11，隨后被證明可誘導(dǎo)那些高表達GSDME的細(xì)胞系的焦亡型死亡，而這些藥物則誘導(dǎo)GSDME陰性細(xì)胞的凋亡。因此，表達低水平GSDME的小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞在誘導(dǎo)凋亡時不會經(jīng)歷GSDME依賴的焦亡，即使這一過程存在著GSDME的加工。然而，GSDME可能是化療治療中一些副作用出現(xiàn)的原因，因為與野生型小鼠相比，Gsdme-/-小鼠更能抵抗順鉑注射引起的組織損傷和體重減輕。因此，GSDME有可能以細(xì)胞類型特異性的方式將細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)化為細(xì)胞焦亡型死亡。

Pejvakin

PJVK突變也與人類和小鼠的聽力損傷有關(guān)。與導(dǎo)致常染色體顯性聽力損失的GSDME突變不同，PJVK的所有已知突變都會造成常染色體隱性聽力損傷，這種受損是由于功能障礙的外毛細(xì)胞(outer hair cells)引發(fā)的。有趣的是，研究表明Pjvk-/-小鼠表現(xiàn)出早發(fā)性進行性聽力損失的聽覺表型，類似于攜帶PJVK突變的患者。這與所有其他gasdermin家族成員不同，在gasdermin家族中，敲除小鼠沒有顯示出肉眼可見的表型，這表明PJVK的突變實際上導(dǎo)致了功能喪失型表型(loss-of-function)。雖然尚未證明PJVK NT結(jié)構(gòu)域在孔形成方面的功能，但其生理功能可能需要PJVK即使在沒有刺激的情況下也持續(xù)活躍，即形成孔。事實上，PJVK CT結(jié)構(gòu)域要短得多，并且與其他gasdermin家族成員沒有明顯的同源性(參考Supplementary Figure 1)，因此PJVK CT結(jié)構(gòu)域可能無法充當(dāng)抑制性結(jié)構(gòu)域。有趣的是，有人提出PJVK定位于內(nèi)毛細(xì)胞中的過氧化物酶體的膜上，并且它能直接招募自噬蛋白LC3B來驅(qū)動在噪聲過度暴露時引起的氧化應(yīng)激之后，由自噬介導(dǎo)的受損過氧化物酶體(Pexophagy)的清除。PJVK驅(qū)動的pexophagy隨后就是過氧化物酶體的增殖，從而保護聽覺毛細(xì)胞免受氧化損傷。事實上，Pjvk-/-小鼠表現(xiàn)出過氧化物酶體功能障礙和抗氧化防御受損的跡象，并且Pjvk-/-毛細(xì)胞中的過氧化物酶體在聽覺誘發(fā)后就顯示出結(jié)構(gòu)異常。有人認(rèn)為，這有助于Pjvk-/-小鼠和攜帶有PJVK突變的人對聲音的異常易感性，從而導(dǎo)致進行性聽力損失。

抑制gasdermins與治療

鑒于GSDMD在炎癥小體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和細(xì)胞因子釋放中的關(guān)鍵作用，針對gasdermin孔的抑制正在成為抗炎治療的新靶點。抑制焦亡作用的思路來自于對這種類型的細(xì)胞死亡的初次研究，研究表明細(xì)胞的裂解可以被滲透保護劑(osmoprotectant)或高濃度的甘氨酸(在毫摩爾范圍內(nèi))阻斷。然而，這一策略并不阻止分子直接通過GSDMD孔隙(如攝取染料或IL-1β釋放)，因此不適合于靶向GSDMD的相關(guān)炎癥。第一種被發(fā)現(xiàn)能夠阻止焦亡和IL-1β釋放的化合物是石榴多酚(Penicalagin)，這是一種在石榴中發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜的抗氧化劑多酚。石榴多酚能可逆地抑制細(xì)胞膜通透性和caspase 1活化后成熟的IL-1β和IL-18的釋放，在低微摩爾范圍內(nèi)具有半最大抑制濃度(IC50)，而不影響GSDMD NT的產(chǎn)生。石榴多酚不影響NLRP3或AIM2炎性小體活化，但能阻斷細(xì)胞膜的流動性，并可能干擾GSDMD NT正確地插入細(xì)胞膜，阻止其寡聚化和/或孔的形成。最近，一份報告表明，石榴多酚影響NlrP1和NLRC4炎性小體的活化；然而，由于石榴多酚以干擾細(xì)胞膜流動性和外源顆粒和蛋白質(zhì)的攝取，因此在刺激前應(yīng)用時，它也可能干擾細(xì)菌性炎癥小體活化劑(如鞭毛蛋白或炭疽致死因子)向細(xì)胞的傳遞。因此，需要進一步的研究來了解石榴多酚的作用機制及其對GSDMD的潛在特異性。體外實驗表明，經(jīng)石榴多酚清洗后，可以觀察到快速的細(xì)胞溶解，這種溶解可以被鑭系元素(La3+和Gd3+)所阻斷。這些金屬化學(xué)元素也被發(fā)現(xiàn)能抑制巨噬細(xì)胞中在焦亡前細(xì)胞膜孔的形成。然而，鑭系元素是否影響細(xì)胞膜上的GSDMD NT寡聚化尚不清楚，因為它們不能阻斷IL-1β釋放。

最近報道了幾種化合物能直接靶向GSDMD。例如，necrosulfonamide(NSA)是一種先前已知的半胱氨酸反應(yīng)性藥物，此化合物能夠抑制壞死性凋亡(necroptosis)中人混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域(MLKL,mixed-lineage kinase domain-like pseudo- kinase)，它也能抑制人源和鼠源細(xì)胞的焦亡。NSA與GSDMD結(jié)合并抑制細(xì)胞膜上的GSDMD NT的寡聚化，但不影響Toll樣受體信號傳導(dǎo)、炎癥小體的活化、GSDMD的裂解或細(xì)胞因子的成熟。在低微摩爾范圍內(nèi)，NSA能阻斷炎癥小體活化時的細(xì)胞膜通透性和IL-1β釋放，并保護小鼠免受內(nèi)毒素誘導(dǎo)的小鼠感染。從機制上講，NSA能共價修飾GSDMD的Cys191，這是孔形成所必需的殘基。有趣的是，NSA不影響GSDME NT誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，這與GSDME中同樣的位點缺少一個半胱氨酸的效應(yīng)是一致的。另一種化合物是LDC7559，據(jù)報道該化合物可抑制在小鼠或人類細(xì)胞中發(fā)生的彈性蛋白酶依賴性的NETosis或焦亡，但其作用機制至今尚不清楚。

結(jié)論與展望

自從GSDMD被鑒定為焦亡的執(zhí)行者以來，我們對這個新興的細(xì)胞死亡執(zhí)行者家族的了解取得了快速的進展。對全長gasdermins的結(jié)構(gòu)和誘變以及GSDMA3 NT孔隙的結(jié)構(gòu)研究已經(jīng)揭示了自抑制和膜插入的機制。此外，大量研究表明，在炎癥小體誘導(dǎo)的焦亡之外，gasdermins還參與細(xì)胞死亡，例如在出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)后發(fā)生后的NETosis和壞死死亡過程中。另一方面，對gasdermin孔隙的非裂解功能的鑒定擴展了gasdermins的已知功能，提示了gasdermin在非常規(guī)蛋白質(zhì)分泌中的關(guān)鍵作用。

很明顯，這些研究只是冰山的一角，在未來幾年中，gasdermin家族將成為免疫、癌癥治療和其他領(lǐng)域的核心參與者。然而，許多問題仍未得到解答。例如，了解不同gasdermins的活化機制，哪些細(xì)胞類型能產(chǎn)生這些活性gasdermins，以及它們將引發(fā)什么生物學(xué)效應(yīng)，這都是非常重要的問題。目前尚不清楚不同的GSDMB和GSDMC是否具有不同的作用(GSDMB和GSDMC的功能在很大程度上是未知的)，以及是否所有的GSDMB都具有炎癥和宿主防御微生物感染方面的功能。

隨著知識的進步，gasdermin活性的藥理調(diào)節(jié)有可能成為治療具有炎癥成分的不同疾病的關(guān)鍵。特異性gasdermin阻滯劑的表征以及驗證焦亡是一個可行的藥理學(xué)靶點才剛剛開始。在許多體內(nèi)模型和臨床試驗中，已經(jīng)用化學(xué)抑制劑或阻斷抗體證實了阻斷炎性小體-IL-1途徑在臨床方面的意義，針對IL-1的阻斷抗體已經(jīng)被批準(zhǔn)用于治療自身炎癥和慢性炎癥性疾病。新型gasdermin阻滯劑的開發(fā)不僅對理解焦亡孔在不同疾病中的作用具有重要意義，而且還將為開發(fā)新的炎癥性疾病治療方案鋪平道路。