來(lái)源：http://blog.sciencenet.cn/blog-3431904-1251930.html
已有 6251 次閱讀 2020-9-24 17:25 |系統(tǒng)分類(lèi):科研筆記
鎖核酸（LNA）是一種含有橋接雙環(huán)糖基（bridged, bicyclic sugar moiety）的合成核酸類(lèi)似物。
在2'-O-和4'-位之間添加的亞甲基基團(tuán)將呋喃核糖環(huán)“鎖定”為3'-內(nèi)構(gòu)象（3'-endo conformation）。這種構(gòu)象形成了A型RNA的特征結(jié)構(gòu)。由于這種雙環(huán)糖骨架的限制，LNA只會(huì)形成A型雙鏈體。此外，LNA完全遵守Watson-Crick的堿基配對(duì)原則。因此LNA:DNA雜交雙鏈體可以由序列互補(bǔ)的DNA和LNA自發(fā)形成，并且研究發(fā)現(xiàn)，LNA:DNA雜交體與其對(duì)應(yīng)的DNA:DNA相比，其退火溫度會(huì)大幅度升高。由于LNA的合成與標(biāo)準(zhǔn)寡核苷酸合成相容，因此可以直接將單個(gè)或多個(gè)LNA核苷酸位點(diǎn)選擇性地?fù)饺隓NA序列中。這些含有LNA的寡核苷酸與它們互補(bǔ)的DNA序列退火后形成嵌合LNA:DNA雜交體。這些雜交體也均為A 型構(gòu)象，并且與相應(yīng)的DNA:DNA雙鏈相比，Tm值也會(huì)顯著升高。粗略估算，DNA引物（<30 nt）中每摻入一個(gè)LNA核苷酸可使Tm值增加3-8℃。總而言之，LNA的主要優(yōu)點(diǎn)在于其可對(duì)所需寡核苷酸的Tm值進(jìn)行微調(diào)，從而成為引物和探針設(shè)計(jì)時(shí)的選擇。由于結(jié)合親和力更強(qiáng)，所以可以合成更短的探針，同時(shí)其對(duì)目的DNA的結(jié)合特異性也更強(qiáng)。因此，推薦將 LNA 用于需要高特異性和/或可重復(fù)性的任何雜交檢測(cè)，例如PCR引物、雙標(biāo)記探針、原位雜交探針和分子信標(biāo)。此外，由于相同的原因，LNA 修飾的寡核苷酸也可以成為反義藥物開(kāi)發(fā)的一種理想的候選物。
增強(qiáng)對(duì)單核苷酸的識(shí)別
摻入LNA 核苷酸后，由于LNA在錯(cuò)配位點(diǎn)形成Watson-Crick堿基對(duì)的傾向更強(qiáng)烈，因此qPCR 探針通過(guò)單核苷酸多態(tài)性（SNP）區(qū)分等位基因的能力會(huì)大大增強(qiáng)（Johnson et al., 2004）。熱變性研究表明，當(dāng)LNA 摻入在寡核苷酸的特定位置時(shí)，完美匹配和錯(cuò)配之間的 Tm 值存在顯著差異。因此，在 SNP 測(cè)定中，與天然狀態(tài)DNA探針相比，LNA qPCR探針雜交具有更強(qiáng)的不穩(wěn)定性，因此能夠更好地區(qū)分出錯(cuò)配。
Johnson, M. P.; Haupt, L. M.; Grifiths, L. R. Locked nucleic acid (LNA) single nucleotide polymorphism (SNP) genotype analysis and validation using real-time PCR. Nucleic acids research 2004, 32 (6), e55.
Influence of LNA on the melting temperature (Tm) and the resulting larger difference between specific (1p) and non-specific (1m) signals
反義技術(shù)（Antisense Technology）
由于對(duì)互補(bǔ)核酸的結(jié)合親和力增強(qiáng)，LNA很有可能被用于反義技術(shù)，與此同時(shí)LNA的高核酸酶抗性是體內(nèi)和體外應(yīng)用的重要優(yōu)勢(shì)。大量研究證實(shí)了LNA作為反義試劑的優(yōu)越性，常規(guī)技術(shù)即可用于轉(zhuǎn)染LNA寡核苷酸。對(duì)于knockdown microRNA或其他小RNA等實(shí)驗(yàn)?zāi)康模梢酝ㄟ^(guò)設(shè)計(jì)LNA反義寡核苷酸以通過(guò)堿基配對(duì)與其靶序列雜交。另外，還可以通過(guò)引入硫代磷酸酯骨架以獲得更強(qiáng)的核酸酶抗性。
以Exiqon公司基于LNA專(zhuān)利技術(shù)的microRNA檢測(cè)平臺(tái)（Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片）為例：
Exiqon的LNATM專(zhuān)利技術(shù)解決microRNA PCR檢測(cè)的兩大難題：
LNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)。LNA能夠提高引物與靶標(biāo)分子的穩(wěn)定性，增加引物的熔解溫度（Tm值）；也就是說(shuō)，LNA Oligos在更短的長(zhǎng)度情況下，能夠保持很高的Tm值。
左圖堿基進(jìn)行LNA修飾后△Tm值顯著增加，PCR交叉反應(yīng)的可能性大大降低。右圖，人工合成序列相似的microRNA分子，用Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片的檢測(cè)結(jié)果。
Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片反應(yīng)原理：
Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片特點(diǎn)（結(jié)合其他公司的圖片進(jìn)行說(shuō)明）：
- 靈敏度高。檢測(cè)單個(gè)microRNA僅需1pg總RNA。從1個(gè)細(xì)胞提取的10pg總RNA就足夠用于檢測(cè)microRNA了。
- 特異性強(qiáng)。經(jīng)LNA修飾的PCR引物，可有效區(qū)分microRNA之間的單堿基差異。
- 準(zhǔn)確性高。
質(zhì)控嚴(yán)格。
重復(fù)性高
參考以下公司或網(wǎng)站的資料，一并感謝！
http://www.kangchen.com.cn/support/supportmain.asp?ID=31，https://wenku.baidu.com/view/5ed186addd3383c4bb4cd2b2.html，
