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已有 6251 次閱讀 2020-9-24 17:25 |系統(tǒng)分類:科研筆記
鎖核酸（LNA）是一種含有橋接雙環(huán)糖基（bridged, bicyclic sugar moiety）的合成核酸類似物。
在2'-O-和4'-位之間添加的亞甲基基團將呋喃核糖環(huán)“鎖定”為3'-內構象（3'-endo conformation）。這種構象形成了A型RNA的特征結構。由于這種雙環(huán)糖骨架的限制，LNA只會形成A型雙鏈體。此外，LNA完全遵守Watson-Crick的堿基配對原則。因此LNA:DNA雜交雙鏈體可以由序列互補的DNA和LNA自發(fā)形成，并且研究發(fā)現(xiàn)，LNA:DNA雜交體與其對應的DNA:DNA相比，其退火溫度會大幅度升高。由于LNA的合成與標準寡核苷酸合成相容，因此可以直接將單個或多個LNA核苷酸位點選擇性地摻入DNA序列中。這些含有LNA的寡核苷酸與它們互補的DNA序列退火后形成嵌合LNA:DNA雜交體。這些雜交體也均為A 型構象，并且與相應的DNA:DNA雙鏈相比，Tm值也會顯著升高。粗略估算，DNA引物（<30 nt）中每摻入一個LNA核苷酸可使Tm值增加3-8℃?？偠灾?，LNA的主要優(yōu)點在于其可對所需寡核苷酸的Tm值進行微調，從而成為引物和探針設計時的選擇。由于結合親和力更強，所以可以合成更短的探針，同時其對目的DNA的結合特異性也更強。因此，推薦將 LNA 用于需要高特異性和/或可重復性的任何雜交檢測，例如PCR引物、雙標記探針、原位雜交探針和分子信標。此外，由于相同的原因，LNA 修飾的寡核苷酸也可以成為反義藥物開發(fā)的一種理想的候選物。
增強對單核苷酸的識別
摻入LNA 核苷酸后，由于LNA在錯配位點形成Watson-Crick堿基對的傾向更強烈，因此qPCR 探針通過單核苷酸多態(tài)性（SNP）區(qū)分等位基因的能力會大大增強（Johnson et al., 2004）。熱變性研究表明，當LNA 摻入在寡核苷酸的特定位置時，完美匹配和錯配之間的 Tm 值存在顯著差異。因此，在 SNP 測定中，與天然狀態(tài)DNA探針相比，LNA qPCR探針雜交具有更強的不穩(wěn)定性，因此能夠更好地區(qū)分出錯配。
Johnson, M. P.; Haupt, L. M.; Grifiths, L. R. Locked nucleic acid (LNA) single nucleotide polymorphism (SNP) genotype analysis and validation using real-time PCR. Nucleic acids research 2004, 32 (6), e55.
Influence of LNA on the melting temperature (Tm) and the resulting larger difference between specific (1p) and non-specific (1m) signals
反義技術（Antisense Technology）
由于對互補核酸的結合親和力增強，LNA很有可能被用于反義技術，與此同時LNA的高核酸酶抗性是體內和體外應用的重要優(yōu)勢。大量研究證實了LNA作為反義試劑的優(yōu)越性，常規(guī)技術即可用于轉染LNA寡核苷酸。對于knockdown microRNA或其他小RNA等實驗目的，可以通過設計LNA反義寡核苷酸以通過堿基配對與其靶序列雜交。另外，還可以通過引入硫代磷酸酯骨架以獲得更強的核酸酶抗性。
以Exiqon公司基于LNA專利技術的microRNA檢測平臺（Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片）為例：
Exiqon的LNATM專利技術解決microRNA PCR檢測的兩大難題：
LNA的化學結構。LNA能夠提高引物與靶標分子的穩(wěn)定性，增加引物的熔解溫度（Tm值）；也就是說，LNA Oligos在更短的長度情況下，能夠保持很高的Tm值。
左圖堿基進行LNA修飾后△Tm值顯著增加，PCR交叉反應的可能性大大降低。右圖，人工合成序列相似的microRNA分子，用Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片的檢測結果。
Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片反應原理：
Exiqon miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR芯片特點（結合其他公司的圖片進行說明）：
- 靈敏度高。檢測單個microRNA僅需1pg總RNA。從1個細胞提取的10pg總RNA就足夠用于檢測microRNA了。
- 特異性強。經LNA修飾的PCR引物，可有效區(qū)分microRNA之間的單堿基差異。
- 準確性高。
質控嚴格。
重復性高
參考以下公司或網(wǎng)站的資料，一并感謝！
http://www.kangchen.com.cn/support/supportmain.asp?ID=31，https://wenku.baidu.com/view/5ed186addd3383c4bb4cd2b2.html，
