8月14日，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)豬遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃路生院士團(tuán)隊(duì)聯(lián)合四川農(nóng)業(yè)大學(xué)李明洲教授團(tuán)隊(duì)，在Nature Communications雜志上在線發(fā)表題為“Mechanism of Parent-of-origin Effects revealed by Multi-omic data in Euro-Chinese Hybrid Pigs”的研究論文。該研究構(gòu)建了全球首個(gè)同時(shí)含染色質(zhì)構(gòu)象、DNA甲基化及多種組蛋白修飾的雜交豬父母相高分辨率表觀圖譜，系統(tǒng)揭示了其在親本效應(yīng)（Parent-of-origin effects, POE）中的協(xié)同調(diào)控機(jī)制。
PART.01研究背景
在哺乳動(dòng)物中，絕大多數(shù)基因通常被認(rèn)為在父母兩套染色體之間等效表達(dá)。然而，越來越多的研究表明，部分基因的表達(dá)受其遺傳來源影響，即存在親本效應(yīng)（POE)。該現(xiàn)象不僅參與早期胚胎發(fā)育過程，也與多種疾病的發(fā)生和動(dòng)物性狀的形成密切相關(guān)，是揭示復(fù)雜性狀遺傳機(jī)制的關(guān)鍵突破口之一。在畜牧遺傳育種中，親本效應(yīng)與雜交優(yōu)勢(shì)（heterosis）密切相關(guān)。研究表明，不同親本來源的等位基因在雜交子代中常常呈現(xiàn)表達(dá)偏好，這種表達(dá)偏好可直接影響諸如脂肪沉積、肌肉生長、繁殖性能等經(jīng)濟(jì)性狀的表達(dá)。因此，闡明親本效應(yīng)的調(diào)控機(jī)制不僅有助于揭示雜交優(yōu)勢(shì)的分子基礎(chǔ)，也為定向育種和分子設(shè)計(jì)育種提供理論支撐和精準(zhǔn)工具。
PART.02研究結(jié)果
1、數(shù)據(jù)集的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與質(zhì)量控制
研究團(tuán)隊(duì)通過三組歐洲商品豬與中國地方豬的雜交組合（大白×二花臉，杜洛克×兩廣，巴克夏×贛西），構(gòu)建特殊父親-母親-孩子三元核心家系，并整合短讀長測(cè)序、長讀長測(cè)序（ONT）、全長轉(zhuǎn)錄組（PacBio）、甲基化測(cè)序（TAPS）、CUT&Tag（5種組蛋白標(biāo)記）、Hi-C等多組學(xué)數(shù)據(jù)（圖1a)。為保證研究結(jié)果的可靠性，作者對(duì)所有數(shù)據(jù)集進(jìn)行了嚴(yán)格質(zhì)控。RNA測(cè)序顯示BF與LD基因表達(dá)譜有明顯差異（圖1b)；背膘（BF）甲基化水平整體高于背最長肌（LD），兩種組織中轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）均呈現(xiàn)顯著低甲基化特征（圖1c）；不同組蛋白修飾和CTCF在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)周圍富集（圖1e)；Hi-C數(shù)據(jù)捕獲到高分辨率基因組空間互作（圖1f）。
2、雜交基因組的單倍型解析與溯源
基于三重家系基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，開發(fā)了一種名為"phase-tag"的單倍型分型策略，用于在全基因組水平探究等位基因特異性表達(dá)及其表觀遺傳調(diào)控機(jī)制（圖2a）。作者對(duì)分型流程的準(zhǔn)確性與效率進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)估，親本等位基因間相位分配錯(cuò)誤的比例在所有雜交后代中介于0.19%至0.25%之間，處于正常范圍內(nèi)（圖2b），全基因組中成功標(biāo)記父源和母源reads的比例為48.93%-63.02%（圖2c）。由于單倍型分型流程高度依賴于SNP密度與分布的均勻性，該研究檢測(cè)了全基因組SNP的分布情況以評(píng)估可分型reads的基因組覆蓋度（圖2d）。變異位點(diǎn)的平均間隔約為250bp/SNP，但仍存在部分區(qū)域SNP間隔大于10kb，這些區(qū)域阻礙了reads親本來源的準(zhǔn)確區(qū)分。phase-tag策略與傳統(tǒng)reads分型方法trio binning產(chǎn)生的k-mer存在高度重疊（共有率達(dá)86%），但phase-tag策略在等位基因特異性k-mer的識(shí)別方面表現(xiàn)出更強(qiáng)能力：當(dāng)trio binning策略仍存在部分親-子代雜合位點(diǎn)無法區(qū)分時(shí)，phase-tag能通過相鄰已分型變異位點(diǎn)的"搭車"效應(yīng)實(shí)現(xiàn)有效分型（圖2e，附圖2c）
3、父源與母源單倍型在基因表達(dá)、DNA甲基化、組蛋白修飾及染色質(zhì)構(gòu)象方面的差異圖譜
共計(jì)在BF和LD中分別鑒定出7,466和6,544個(gè)相位特異性表達(dá)基因（PSEs），其中3,848個(gè)基因在兩種組織中共同存在（圖3a）。BF和LD高甲基化區(qū)域呈現(xiàn)相似分布規(guī)律：高甲基化區(qū)域主要富集于3'UTR和5'UTR（圖3b）。在LD和BF中分別共有465個(gè)和310個(gè)相位特異性組蛋白修飾（PSHMs）與相位特異性CTCF結(jié)合（PSCTCFs）在超過半數(shù)樣本中穩(wěn)定存在（圖3c）。通過分型 Hi-C 圖譜，鑒定出了相位特異性三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，有 672 個(gè)染色質(zhì)區(qū)室表現(xiàn)為 “父本相位為 A 區(qū)室、母本相位為 B 區(qū)室” 的轉(zhuǎn)換模式，另有 679 個(gè)染色質(zhì)區(qū)室呈現(xiàn)相反的轉(zhuǎn)換模式（父本階段為 B 區(qū)室、母本階段為 A 區(qū)室），這些相位特異性區(qū)室在父本和母本相位的分布無顯著差異（圖 3d）。鑒定出7,884個(gè)相位特異性TAD邊界（PSTAD邊界），其中65.6%呈現(xiàn)典型差異模式，表明在某一相位中出現(xiàn)了新的 TAD 邊界，且形成了相位特異性亞 TAD(圖3e)。多組學(xué)整合分析進(jìn)一步探究了BF和LD中PSEs與相位特異性表觀遺傳修飾之間的關(guān)聯(lián)。兩種組織內(nèi)均發(fā)現(xiàn)相似比例的關(guān)聯(lián)模式：BF中32.87%的PSEs與單一表觀遺傳標(biāo)記相關(guān)聯(lián)， LD中該比例為31.41%。此外， BF中35.53%及LD中52.15%的PSEs受到多于一種表觀遺傳標(biāo)記的協(xié)同調(diào)控（圖3f）。
4、DNA甲基化調(diào)控的親本效應(yīng)
系統(tǒng)分析了PSEs與相位特異性甲基化區(qū)域（PSMRs）的位置關(guān)系。結(jié)果顯示PSEs的分布與PSMRs高度相似，其中包含31個(gè)已知印記基因（占印記基因數(shù)據(jù)庫收錄量的70%）（圖4a）。以類印記基因?yàn)槟Ｐ停治隽擞H本相位間啟動(dòng)子甲基化差異與基因表達(dá)差異的相關(guān)性。在BF（p?=?0.0079）和LD（p?=?3e-5）中，都觀察到啟動(dòng)子甲基化水平與基因表達(dá)水平之間存在顯著的負(fù)相關(guān)（圖4b）。在組織間共有的類印記基因中，53.71%的基因啟動(dòng)子區(qū)域受到 PSMRs 的負(fù)調(diào)控。典型的是四個(gè)已知的印記基因：PEG3、SNRPN、NDN 和 MAGEL2（圖4c）。
ADH1C基因啟動(dòng)子區(qū)的PSMR與其偏好表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且在脂肪組織和背最長肌中高度保守（圖4d,e）。在父源相位中該啟動(dòng)子高度甲基化導(dǎo)致低表達(dá)，而母源相位則呈現(xiàn)低甲基化與高表達(dá)特征，提示ADH1C可能是一個(gè)受DNA甲基化調(diào)控的新型印記基因。對(duì)ADH1C轉(zhuǎn)錄本的進(jìn)一步分析顯示，BF中轉(zhuǎn)錄本多樣性更高，但兩種組織主要轉(zhuǎn)錄本均呈現(xiàn)相似的母源表達(dá)模式。此外，母源相位所有轉(zhuǎn)錄本的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域均呈現(xiàn)DNA甲基化水平降低，這進(jìn)一步揭示了相位特異性表達(dá)的形成機(jī)制（圖4f,g）。
5、相位特異性組蛋白修飾與相位特異性染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)控的親本效應(yīng)
在BF和LD中，差異H3K27ac、H3K4me3、H3K4me1和CTCF轉(zhuǎn)錄因子水平與PSEs均呈顯著正相關(guān)（差異H3K27me3除外），支持了相位特異性組蛋白修飾（PSHM）在調(diào)控親本效應(yīng)中的潛在作用（圖5a）。在啟動(dòng)子區(qū)域，BF和LD中共鑒定到1643個(gè)與PSHM相關(guān)的PSEs，其中196個(gè)為組織共享基因，639個(gè)為BF特異性基因，808個(gè)為LD特異性基因（圖5b，c）。
研究發(fā)現(xiàn)組織間保守的PSEs受相似PSHM模式調(diào)控，在BF和LD中呈現(xiàn)相同的相位偏好性。THYN1和PLAC8在兩個(gè)組織中均顯示較高的父源表達(dá)，這與它們啟動(dòng)子區(qū)域父源H3K27ac和H3K4me3信號(hào)增強(qiáng)相關(guān)（圖5d,e）。組織特異性PSEs受相應(yīng)的組織特異性PSHM調(diào)控。與小鼠體重增加相關(guān)的BF特異性PSE——IMMP2L基因，在其啟動(dòng)子區(qū)域顯示較高的母源表達(dá)及母源H3K27ac信號(hào)增強(qiáng)，而在LD中父母源間的表達(dá)與組蛋白修飾信號(hào)則保持平衡（圖5f,g）。
MTSS1 基因表現(xiàn)出更高的父源表達(dá)，這與上游調(diào)控區(qū)域中 H3K27ac 和 H3K4me1 信號(hào)的增強(qiáng)相關(guān)，該上游調(diào)控區(qū)域通過一個(gè)階段平衡的環(huán)與啟動(dòng)子相連（圖 6a）。為驗(yàn)證增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作（EPI）關(guān)系，在豬成纖維細(xì)胞中進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。將包含 MTSS1 基因上游調(diào)控區(qū)域的元件進(jìn)行克隆并導(dǎo)入細(xì)胞。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生了顯著更高的熒光素酶信號(hào)（圖 6b） 。
在LD中，3C-qPCR結(jié)果證實(shí)了啟動(dòng)子與調(diào)控元件間的互作關(guān)系（圖6c，補(bǔ)充數(shù)據(jù)9）。為進(jìn)一步證實(shí)該互作的功能相關(guān)性，在豬成纖維細(xì)胞中進(jìn)行了CRISPR/Cas9介導(dǎo)的增強(qiáng)子區(qū)域敲除實(shí)驗(yàn)。增強(qiáng)子敲除導(dǎo)致MTSS1表達(dá)顯著下調(diào)（圖6d,e），這些結(jié)果表明PSHM可作為調(diào)控元件控制PSE。
6、多組學(xué)分析揭示親本效應(yīng)的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制
作者在兩種組織中，對(duì)PSEs內(nèi)的PSMR進(jìn)行共定位分析，結(jié)果顯示H3K27ac、H3K4me3、H3K4me1和CTCF主要與低甲基化相位共定位，而H3K27me3則主要與高甲基化相位共定位（圖7a）。
利用豬的多組學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)在人類和小鼠中已被充分研究的印記基因 IGF2 和 H19 進(jìn)行了研究。母本 印記控制區(qū)（ICR） 的未甲基化則會(huì)促進(jìn) CTCF 結(jié)合。CTCF 與 ICR 結(jié)合后，會(huì)在 IGF2 和 H19 之間形成絕緣子，既阻止增強(qiáng)子激活 IGF2，又促進(jìn) H19 表達(dá)（圖 7b）；而父本ICR 的甲基化會(huì)阻礙 CTCF 結(jié)合，導(dǎo)致 IGF2 與 H19 之間無法形成絕緣子，增強(qiáng)子得以激活 IGF2 表達(dá)（圖 7b、c）。
該研究還發(fā)現(xiàn)，SGCE–PEG10基因座呈現(xiàn)出與H19–IGF2相似的調(diào)控模式，受相位特異性表觀修飾組合的協(xié)同調(diào)控。SGCE和PEG10的啟動(dòng)子區(qū)域存在相位特異性甲基化（PSMR），表現(xiàn)為母本等位基因高甲基化，父本等位基因低甲基化。CTCF特異性結(jié)合于未甲基化的等位基因，并伴隨較高的H3K27ac和H3K4me3信號(hào)（圖7d）。進(jìn)一步對(duì)等位基因間染色質(zhì)互作頻率的分析顯示，在PSMR上游100-250 kb區(qū)域存在顯著的父本特異性差異（圖7e），強(qiáng)化了該邊界的絕緣功能。這些結(jié)果都證明，SGCE和PEG10啟動(dòng)子區(qū)的PSMR作為印記控制區(qū)發(fā)揮作用，通過調(diào)控CTCF結(jié)合形成PSTAD邊界，并實(shí)現(xiàn)相位特異性增強(qiáng)子-啟動(dòng)子互作（EPI），最終導(dǎo)致SGCE-PEG10的印記表達(dá)（圖7f）。
PART.03研究總結(jié)
1.研究系統(tǒng)解析了DNA甲基化、組蛋白修飾和三維染色質(zhì)結(jié)構(gòu)如何共同調(diào)控肌肉和脂肪組織中的親本效應(yīng)（POE）。
2.研究拓展了豬中H19–IGF2和SGCE–PEG10這兩個(gè)經(jīng)典印記基因的調(diào)控模型，為理解復(fù)雜性狀遺傳中等位基因特異性表觀遺傳調(diào)控提供了理論框架。
