需求

??由于某些特定的環(huán)境，可能老師能夠得到完整的細(xì)胞核，得不到完整的細(xì)胞，但是又想研究其細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，就只能用細(xì)胞核進(jìn)行10xGenomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析；或者有的老師就想研究細(xì)胞核內(nèi)的mRNA與胞質(zhì)mRNA（或者成熟mRNA）的差異或者調(diào)控的差異，也需要研究細(xì)胞核的mRNA。

方法策略

??不管是細(xì)胞核內(nèi)還是胞質(zhì)的mRNA，本質(zhì)都是mRNA，都是從基因組上轉(zhuǎn)錄下來的序列，序列有相同的也有不同的，我們現(xiàn)在研究細(xì)胞核的mRNA，就需要考慮他們之間的差異，我們?yōu)槭裁床荒苤苯佑冒|(zhì)mRNA的方法研究細(xì)胞核mRNA呢？主要是由于細(xì)胞核內(nèi)的mRNA不是成熟的mRNA，是前提mRNA，除了有外顯子序列以外，還有很多內(nèi)含子（mRNA加工過程簡(jiǎn)介），而10xGenomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組比對(duì)的時(shí)候是考慮的外顯子比對(duì)，因此如果直接用胞質(zhì)mRNA比對(duì)方法進(jìn)行細(xì)胞核mRNA比對(duì)，將會(huì)比對(duì)率低的情況。

pre-mRNA to mRNA

??針對(duì)這個(gè)問題，10xGenomics官方提供了解決方案：Cell Ranger compatible "pre-mRNA" reference，既然是由于外顯子比對(duì)的問題，那么就解決比對(duì)情況即可。因此10xGenomics官方建議我們直接在修改參考基因組，直接提取gtf中第三列為transcript的行，然后將transcript改成外顯子，這樣這些聚類就是基因組上序列，包含了內(nèi)含子序列。

??建議命令：

awk 'BEGIN{FS="\t"; OFS="\t"} $3 == "transcript"{ $3="exon"; print}' \
       refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0/genes/genes.gtf > GRCh38-1.2.0.premrna.gtf
#完成對(duì)gtf文件進(jìn)行處理后，然后重新生成參考基因組，命令如下
cellranger mkref --genome=GRCh38-1.2.0_premrna \
                   --fasta=refdata-cellranger-GRCh38-1.2.0/fasta/genome.fa \
                   --genes=GRCh38-1.2.0.premrna.gtf

然后用新的參考基因組進(jìn)行比對(duì)，做后續(xù)分析。

結(jié)果比較

??為了比較評(píng)估此方法的可行性，我們用新生成的參考基因組(mRNA)和之前普通的10xGenomics參考基因組(pre_mRNA)進(jìn)行分別進(jìn)行分析，然后看結(jié)果的差異。

mRNA

pre_mRNA

??從上述兩個(gè)圖看出，二者之間的結(jié)果差異挺大，主要體現(xiàn)在基因中位數(shù)，

mRNA：759
pre_mRNA：2123，
造成這個(gè)原因是比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本的序列多少不同，其中比對(duì)到轉(zhuǎn)錄本的比對(duì)率(Reads Mapped Confidently to Transcriptome)分別為：
mRNA：17.6%
pre_mRNA：63.1%
??從上述結(jié)果來看，如果研究細(xì)胞核mRNA或者說研究前體mRNA，按照上述方法對(duì)參考基因組進(jìn)行處理是很有必要的。

參考文檔

Cell Ranger compatible "pre-mRNA" reference

2019年6月3日