1. PRV-EGFP和PRV-mRFP-通過(guò)心臟衍生的偽狂犬病病毒追蹤對(duì)全腦成像
技術(shù)用途與注射策略解釋?zhuān)?/b>
將PRV-EGFP和PRV-mRFP分別注射到左心室壁和右心室壁，可以用于追蹤心臟感知神經(jīng)元或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的投射模式。因?yàn)镻RV具有跨突觸傳播能力，病毒會(huì)從注射部位的組織進(jìn)入神經(jīng)末梢，并沿神經(jīng)通路逆行傳播，從而標(biāo)記相關(guān)的上游神經(jīng)元。
這種方法特別適用于：
探索心臟不同區(qū)域的神經(jīng)支配；
比較左、右心室在神經(jīng)支配網(wǎng)絡(luò)上的差異；
構(gòu)建“腦-心軸”解剖圖譜等研究。
2. fMOST與組織透明化成像
fMOST（fluorescence micro-optical sectioning tomography）是由中國(guó)科學(xué)家發(fā)展的一種高分辨率全腦成像技術(shù)。它的流程包括：
將小鼠大腦用樹(shù)脂包埋；
用極薄的厚度（一般為1 μm）進(jìn)行連續(xù)物理切片；
每切一層，就用共聚焦顯微鏡拍照；
最終拼接還原為完整的單細(xì)胞分辨率的三維大腦圖譜。
優(yōu)點(diǎn)：
分辨率極高（可達(dá)亞細(xì)胞水平）；
成像深度不受限制；
特別適用于腦神經(jīng)元追蹤、腦圖譜繪制。
缺點(diǎn)：
是破壞性的，成像后組織不可逆；
數(shù)據(jù)量極大，處理復(fù)雜。
?? 組織透明化簡(jiǎn)介：
如CLARITY、uDISCO、iDISCO+、SHIELD等技術(shù)，主要原理是將組織中的脂質(zhì)等折射率不均勻部分清除，使組織變得透明，然后使用光片顯微鏡（LSFM）或共聚焦顯微鏡進(jìn)行深層成像。
優(yōu)點(diǎn)：
可保存完整組織（非破壞性）；
可多輪染色、成像；
適合多通道熒光標(biāo)記。
缺點(diǎn)：
分辨率較fMOST低；
透明化過(guò)程復(fù)雜，對(duì)標(biāo)本損傷風(fēng)險(xiǎn)較高；
大樣本清晰度有限。
在注射后第3天，常規(guī)與自主神經(jīng)調(diào)控心臟相關(guān)的區(qū)域（如M1、PVN等）尚未出現(xiàn)病毒標(biāo)記神經(jīng)元（見(jiàn)圖S1），說(shuō)明這些區(qū)域距離心臟較遠(yuǎn)，病毒還未擴(kuò)散到達(dá)。
提示：PRV需要時(shí)間進(jìn)行多突觸跨越，從心臟傳回大腦高階區(qū)域，早期主要集中在腦干和下丘腦。
然而，5.5天時(shí)，出人意料地在大腦皮層的：
M1區(qū)（初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層）
M2區(qū)（次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層）
S1區(qū)（體感皮層）都出現(xiàn)了PRV陽(yáng)性神經(jīng)元，表明這些皮層區(qū)域可能通過(guò)多級(jí)中樞回路參與了心臟的調(diào)控。
在M1（運(yùn)動(dòng)皮層）中 M40 區(qū)，約有1% 的神經(jīng)元共表達(dá) EGFP 和 mRFP，意味著：
“這小部分神經(jīng)元可能通過(guò)神經(jīng)通路同時(shí)調(diào)節(jié)左心室和右心室的活動(dòng)”，即參與雙側(cè)心肌活動(dòng)的中樞控制。
?M1（Primary Motor Cortex，初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層）
位置：大腦背側(cè)皮層，位于中央前區(qū)域。
功能：控制隨意運(yùn)動(dòng)，通過(guò)下行皮質(zhì)-脊髓/腦干通路調(diào)節(jié)肌肉活動(dòng)。
在小鼠中還可能影響內(nèi)臟運(yùn)動(dòng)（如心臟調(diào)控）。
?M2（Secondary Motor Cortex，次級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層）
位置：位于M1前方，接近前額葉。
功能：參與運(yùn)動(dòng)計(jì)劃、整合和準(zhǔn)備，對(duì)復(fù)雜運(yùn)動(dòng)模式和行為調(diào)節(jié)起作用。
在嚙齒類(lèi)中也可能與自主神經(jīng)系統(tǒng)有聯(lián)系。
?M40（M1的一個(gè)皮層亞區(qū)）
屬于 M1 的細(xì)分區(qū)域（皮層地圖編號(hào)系統(tǒng)中），表示特定功能投射區(qū)。
M40在一些腦圖譜（如 Allen Mouse Brain Atlas）中位于 M1 的前側(cè)或中間部分。
功能：可能偏向特定身體部位（如心臟）的運(yùn)動(dòng)控制。
在本實(shí)驗(yàn)中，M40 是發(fā)現(xiàn)EGFP 和 RFP 共標(biāo)記的地方，表明此處神經(jīng)元可能雙側(cè)調(diào)控心室功能。
?S1（Primary Somatosensory Cortex，初級(jí)體感皮層）
位置：緊鄰M1的后方區(qū)域。
功能：負(fù)責(zé)接收和處理來(lái)自身體的觸覺(jué)、本體感覺(jué)、溫度等體感信息。
不屬于傳統(tǒng)意義上的運(yùn)動(dòng)調(diào)控區(qū)域，但可能通過(guò)整合感知信息參與某些反射或調(diào)節(jié)過(guò)程。
M1區(qū)主要由谷氨酸能神經(jīng)元構(gòu)成
M1 是典型的興奮性皮層區(qū)域
c-Fos標(biāo)記：
c-Fos是一個(gè)早期基因的產(chǎn)物，它在神經(jīng)元活躍時(shí)迅速表達(dá)。c-Fos 被用作神經(jīng)活動(dòng)的標(biāo)記。
例如，當(dāng)神經(jīng)元經(jīng)歷了激活或興奮時(shí)，c-Fos 就會(huì)被轉(zhuǎn)錄并表達(dá)。
因此，c-Fos 作為標(biāo)記物表明神經(jīng)元在光遺傳學(xué)刺激后是被激活的。
M4Di 受體：
hM4Di是一種化學(xué)遺傳學(xué)工具，屬于Gi偶聯(lián)型受體。這種受體被設(shè)計(jì)成在**CNO（氯氮平-N-氧化物）**的作用下被激活，抑制神經(jīng)元的活動(dòng)。
hM4Di通常用于“抑制”特定神經(jīng)元的功能，它能通過(guò)CNO（氯氮平-N-氧化物 （CNO））的激活，使相應(yīng)的神經(jīng)元“沉默”或減少其活動(dòng)。
光遺傳學(xué)在激活實(shí)驗(yàn)中的優(yōu)勢(shì)是其時(shí)空精確性和即時(shí)反應(yīng)，使得研究者能夠在非常短的時(shí)間內(nèi)激活特定神經(jīng)元并觀察其對(duì)心臟等生理功能的即時(shí)影響。
化學(xué)遺傳學(xué)更適用于抑制實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樗灰蕾?lài)于光源，可以提供穩(wěn)定的、長(zhǎng)時(shí)間的神經(jīng)元活動(dòng)抑制。
抑制不用光遺傳學(xué)-方便-深部腦結(jié)構(gòu)也不受影響，激活不用化學(xué)遺傳學(xué)-實(shí)時(shí)性較差，激活是很快的事情
化學(xué)遺傳學(xué)
化學(xué)遺傳學(xué)（Chemogenetics）是一種相對(duì)較新的技術(shù)，通過(guò)小分子化學(xué)物質(zhì)與特定的工程化受體相互作用來(lái)調(diào)控神經(jīng)元的活動(dòng)。它是一種結(jié)合了基因工程與藥物調(diào)控的技術(shù)，可以精確地調(diào)節(jié)神經(jīng)元的激活或抑制。與傳統(tǒng)的光遺傳學(xué)不同，化學(xué)遺傳學(xué)不依賴(lài)于光源，而是通過(guò)系統(tǒng)性注射或局部應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)（如CNO等）來(lái)控制神經(jīng)活動(dòng)。這為實(shí)驗(yàn)提供了不同的靈活性和可控性。
主要的化學(xué)遺傳學(xué)工具和原理
DREADDs（Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs）：
DREADDs是化學(xué)遺傳學(xué)中最常用的工具。它們是一類(lèi)通過(guò)基因工程改造的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs），可以在不受體內(nèi)天然配體控制的情況下，通過(guò)外源性的化學(xué)物質(zhì)來(lái)激活或抑制它們的功能。
DREADDs的核心特點(diǎn)是它們可以被特定的小分子藥物（通常是CNO或其類(lèi)似物）激活或抑制，而不受自然配體的影響。常見(jiàn)的DREADDs包括：
hM3Dq（激活性受體）：通過(guò)與CNO結(jié)合，能夠激活下游的G蛋白信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)元的去極化。
hM4Di（抑制性受體）：通過(guò)與CNO結(jié)合，能夠抑制神經(jīng)元活動(dòng)，通常通過(guò)激活G抑制性信號(hào)通路，減少神經(jīng)元的興奮性。
作用機(jī)制：
激活作用：DREADDs如hM3Dq與CNO結(jié)合后，會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，通常是Gq/11通路，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的去極化和激活。
抑制作用：DREADDs如hM4Di與CNO結(jié)合后，會(huì)激活Gi偶聯(lián)通路，通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平或其他機(jī)制來(lái)抑制神經(jīng)元的活動(dòng)。
與光遺傳學(xué)不同，化學(xué)遺傳學(xué)的受體可以通過(guò)注射或口服給藥等方式激活，無(wú)需光照。
特異性消融 M1 區(qū)的興奮性谷氨酸能神經(jīng)元
1.AAV-EF1α-DIO-taCasp3-TEVp：
這是一個(gè)含有雙向鎖定（DIO, Double-floxed Inverse Orientation）的構(gòu)建體，編碼tandem attenuated Caspase-3（taCasp3）和TEVp（Tobacco Etch Virus protease）。
在沒(méi)有 Cre 表達(dá)的細(xì)胞中，這段基因由于被反向插入，不會(huì)被表達(dá)。
一旦有 Cre 重組酶存在，它會(huì)將taCasp3片段翻轉(zhuǎn)到正確方向，從而驅(qū)動(dòng)表達(dá) Caspase-3 和 TEVp，引發(fā)凋亡。
2.AAV-CaMKIIα-Cre-GFP：
這是一個(gè)只在興奮性谷氨酸能神經(jīng)元中（即表達(dá) CaMKIIα 的神經(jīng)元）表達(dá)的 AAV，攜帶Cre 重組酶和 GFP。
CaMKIIα 啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的興奮性神經(jīng)元特異性，所以這使得 Cre 僅在這些細(xì)胞中表達(dá)。
?? 工作原理總結(jié)：
兩種病毒共同注射到 M1 區(qū)（或其他目標(biāo)腦區(qū)）；
只有在表達(dá) CaMKIIα 的興奮性神經(jīng)元中，Cre 才被表達(dá)；
Cre 介導(dǎo) DIO-taCasp3-TEVp 的“解鎖”，使 taCasp3 正向表達(dá)；
taCasp3 是一種“增強(qiáng)型的 Caspase-3”，在 TEVp 的協(xié)助下啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡（凋亡）；
最終導(dǎo)致特異性消融 M1 區(qū)的興奮性谷氨酸能神經(jīng)元。
通過(guò) taCasp3 小鼠中 NeuN （一種成熟神經(jīng)元標(biāo)志物） 陽(yáng)性神經(jīng)元的缺失證實(shí)了 M1 谷氨酸能神經(jīng)元消融
AAV（腺相關(guān)病毒）→ 標(biāo)記 M1 神經(jīng)元、追蹤軸突投射；
用途：
標(biāo)記某類(lèi)神經(jīng)元（如谷氨酸能神經(jīng)元）；
表達(dá)熒光蛋白（EGFP、mCherry）來(lái)示蹤投射；
攜帶 DREADDs、ChR2 等基因，進(jìn)行功能操控。
VSV（Vesicular Stomatitis Virus）→ 進(jìn)行跨突觸的順行追蹤
TPH2（Tryptophan hydroxylase 2）：
是 5-HT（血清素）合成的限速酶，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中血清素能神經(jīng)元的經(jīng)典標(biāo)志物。TPH2 陽(yáng)性 → 說(shuō)明是血清素能神經(jīng)元。
MnR（Median raphe nucleus，中縫核）：
屬于腦干的一部分，含有大量血清素能神經(jīng)元，廣泛參與調(diào)控睡眠、情緒和心血管活動(dòng)。
1. AAV1-hSyn-Cre 注射到 M1：
AAV1 型病毒有一定的順行跨突觸轉(zhuǎn)運(yùn)能力（雖然比 VSV、PRV弱，但可以做到一定程度）。
hSyn 啟動(dòng)子（神經(jīng)元特異性）保證只在神經(jīng)元中表達(dá) Cre 重組酶。
因此：M1 的神經(jīng)元被感染，表達(dá) Cre，同時(shí)通過(guò)突觸把 Cre 轉(zhuǎn)運(yùn)到它們投射連接的下游神經(jīng)元。
2. AAV-DIO-ChR2-mCherry 注射到 MnR：
這個(gè)病毒帶的是一個(gè)DIO（Double-floxed Inverted Open reading frame）構(gòu)建的 ChR2-mCherry，需要 Cre 的存在才能激活表達(dá)；
單獨(dú)注射 DIO-ChR2-mCherry 是不表達(dá)的；
只有接收到 Cre 的 MnR 神經(jīng)元，才能“翻轉(zhuǎn)”基因框架，開(kāi)始表達(dá)ChR2（光敏通道）+ mCherry（紅色熒光標(biāo)記）。
?? 最終實(shí)現(xiàn)了什么？
只激活了：接收來(lái)自 M1 投射的 MnR 神經(jīng)元；
并且這些 MnR 神經(jīng)元能夠在光刺激（藍(lán)光）下通過(guò) ChR2 激活，功能上可以操控 M1 → MnR 的特定回路。
如果只用解剖追蹤（如EGFP標(biāo)記或VSV），只能說(shuō)明“有連接”；
用鈣成像記錄光激后的功能響應(yīng)，才能證明“這些連接是有功能的”——能激活目標(biāo)神經(jīng)元。
分別激活下游的MnR或者M(jìn)1區(qū)域看對(duì)心臟功能的影響。
為什么注入麝香酚會(huì)阻止效果？
注入麝香酚后，MnR 神經(jīng)元的活動(dòng)被過(guò)度激活，可能導(dǎo)致MnR 神經(jīng)回路的過(guò)度激活。這種過(guò)度激活可能會(huì)引起以下幾種效果：
過(guò)度激活抑制正常回路功能：過(guò)度的MnR 神經(jīng)元激活可能會(huì)抑制從M1到MnR 的信號(hào)傳遞。在這種情況下，盡管通過(guò)光刺激激活了M1 神經(jīng)元，但MnR 神經(jīng)元的過(guò)度激活可能干擾了M1 到 MnR 的正常傳遞信號(hào)。
改變自主神經(jīng)活動(dòng)平衡：過(guò)度的MnR 激活可能破壞心臟功能、血壓和自主神經(jīng)活動(dòng)的正常調(diào)節(jié)機(jī)制，從而改變了預(yù)期的生理響應(yīng)。
加疾病-抑制的實(shí)驗(yàn)也做了-我們將 CaMKIIα 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá) AAV 的 hM4Di 注射到 MI 小鼠的 M1 區(qū)，然后結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支并用 CNO 注射刺激，每天一次，連續(xù) 21 天
在心梗條件下，基本上把上述不在疾病條件下的做了一個(gè)遍。
