? ? ? ?桑格測序法，又稱雙脫氧鏈終止反應，與化學降解法以及其衍生方法統(tǒng)稱為第一代DNA測序技術，為人類基因組計劃所使用主要測序方法，人類基因組中用的是基于sanger法的半自動測序儀。其原理是測序反應的核心就是利用ddNTP（由于缺少3'-OH基團，不具有與另一個dNTP連接形成磷酸二酯鍵的能力），這些ddNTP可用來中止DNA鏈的延伸。此外，這些ddNTP上連接有放射性同位素或熒光標記基團，因此可以被自動化的儀器或凝膠成像系統(tǒng)所檢測到。
其測序步驟如下：
首先，將待測序的DNA擴增，就是復制出很多相同的DNA，準備足夠的樣本量?！?/p>
接下來，加熱，使DNA變性。雙鏈DNA就分離開來，成為單鏈DNA，只留下下面的單鏈，稱為模板鏈?！?/p>
將測序引物（primer）和模板鏈結合，從模版連的3’位置開始（圖片中應該是反了，后面圖片都是反的，感謝徐鑫指正?。?，加入引物是因為DNA聚合酶不能重頭復制需要前面有一小段起點。（感謝阿敲指正?。?/p>
然后將添加完測序引物的DNA平均分散在四個反應容器中。為什么是四個？因為DNA由4個堿基組成，分別是：A、T、G、C?！?/p>
接下來，將DNA聚合酶加入到所有四個反應容器中。↓
繼續(xù)添加佐料，將四個基本堿基的原料（dNTP），這些原料還是單個的脫氧核糖核酸，加入到每個反應容器?！?/p>
接下來，關鍵步驟來了，加入特異性ddNTP到反應容器，每個反應容器中只加入一種ddNTP。這里有點復雜，要說一下，什么是特異性ddNTP。ddNTP就是一種變異過的堿基，也有四種，我們姑且稱為A*，T*，G*，C*，他也可以和對應的堿基結合，A*-> T, T*-> A, G*->C, C*->G。但是和普通堿基不同的是，當他們和對應堿基結合后，可以終止后續(xù)的其他結合，就是DNA的鏈式反應就結束了。這樣就產(chǎn)生很多一邊完整（模板單鏈），一邊不完整（因為ddNTP的存在）的DNA分子。如下圖，分別加入不同的ddNTP后↓
以黃色的為例，比如這個黃色容器代表加入ddATP（A*）。↓
因為有DNA聚合酶，還有堿基原料，還有特殊堿基A*，在這個容器內(nèi)開始DNA聚合反應?！?/p>
聚合酶將各個堿基連接到模板鏈上，直至特殊的A*堿基（帶尾巴的黃色塊）和綠色塊T堿基配對，然后聚合反應終止。這里大家要問了，為什么不和前面的兩個綠色結合，直接終止呢？這里要說一句，這里的結合是隨機產(chǎn)生的，所以，有一些運氣好，直接就和第一個綠色塊結合，然后終止了。有些就和第二個綠色塊結合，有些就和后面的綠色塊結合，反正因為樣本足夠，按照概率來說，每個對應的綠色塊都會有機會和特殊A*堿基配對。下圖只是其中一種情況。↓
其他的容器內(nèi)也在發(fā)生相類似的反應。等到反應結束后，將這四個容器內(nèi)的產(chǎn)物，放置到電泳膠上?！?/p>
通電↓
由于其磷酸鹽主鏈賦予的負電荷，DNA從負極開始遷移，較小的較輕長度的DNA進一步遷移到電泳板的底部。剛剛我們提到過，由于ddNTP隨機結合的位置不同，形成的不完整DNA分子，這里不同的DNA分子就被區(qū)分出來了，并且分布在不同的位置上。通過熒光標記的方法，就會在膠片上留下記號?！?/p>
轉自
https://zhuanlan.zhihu.com/p/29270914
https://zh.wikipedia.org/wiki/%E6%A1%91%E6%A0%BC%E6%B5%8B%E5%BA%8F
