1. COVID-19和IAV患者外周血PBMC單細胞轉(zhuǎn)錄圖譜

圖A：患者信息：3個HD，5個COVID19，2個IAV患者；COVID19和IAV各取了不同的時間點的樣本（見圖COVID-19有6個時間點，IAV有3個），一共送了23個樣。
圖B：23個樣本的細胞數(shù)展示。過濾后得到46,022個細胞，平均每個樣本約200細胞。??其實仔細看樣本間細胞數(shù)差挺大的，這個展示方式比較討巧，至少看起來比較均一。
圖C：細胞注釋得到15個細胞群
T(CD3G+, CD4+/CD8A+/CD8B+)：naive T cells (CD3+CCR7+GZMA-), activated CD4+ T cells (CD3+CD4+IL7R+), cytotoxic CD8+ T cells (CD3+CD8+GZMA+), mucosal associated invariant T cells (MAIT cells; CD3+SLC4A10+), and cycling T cells (CD3+MKI67+)
B(MS4A1+)：naive B cells (MS4A1+IGHG1-), plasma cells (MZB1+IGHG1+), cycling plasma cells (MZB1+IGHG1+MKI67+TOP2A+), and memory B cells (CD27+MS4A1+IGHG1+)
Mono(LYZ+CD68+)
NK(KLRF1+XCL1+)
DC(CD1C+LYZ+)
megakaryocytes(PPBP)
stem cells(CD34)
圖D：細胞群marker基因展示（這個圖感覺畫成氣泡圖或者堆疊條形圖會更好）

2. 漿細胞在新冠和IAV患者的外周血中增加

圖A：堆疊條形圖展示23個樣本15種細胞的比例變化
圖B：漿細胞和細胞周期漿細胞在COVID-19和IAV感染患者中比例都明顯增加，但這兩種疾病之間的漿細胞比例沒有顯著性差別。漿細胞主要作用是產(chǎn)生抗體，其比例的增加可能會使中和抗體產(chǎn)生增多以保護機體。
圖C：COVID-19的B細胞和HC的B細胞相比的上調(diào)基因的富集分析結(jié)果結(jié)果顯示蛋白復合體組裝和蛋白轉(zhuǎn)運相關(guān)通路被顯著富集?？赡艿脑蚴沁@個過程中大量蛋白質(zhì)合成增加。此外還富集到了B細胞活化相關(guān)通路。（這里差異基因篩選的標準是adjusted p < 0.01, Foldchange > 2，還算是比較嚴格?？雌饋砗Y出的基因不多。富集分析是用ChIPseeker包做的：compareCluster (fun = "enrichGO,’’ pvalueCutoff = 0.1, pAdjustMethod = "BH,’’ OrgDb = "org.Hs.eg.db,ontBP’’) ）

圖D：漿細胞的特性和功能依賴于轉(zhuǎn)錄因子PRDM1, XBP1和IRF4。和HC相比，COVID-19這三種轉(zhuǎn)錄因子的表達都顯著增加。

??延伸：
PRDM1 has a central role in determining and shaping the secretory arm of mature B cell differentiation and in promoting immunoglobulin (Ig) synthesis.
XBP1 is a positively acting transcription factor in the CREB-ATF family that is expressed at a large amounts in plasma cells and is crucial for increasing protein synthesis in plasma cells.
IRF4 regulates immunoglobulin class-switch recombination, and sustained and higher concentrations of IRF4 are known to promote the generation of plasma cells.

圖E：激活的CD4⁺T細胞表達CD2AP和TNFSF14增加，細胞毒性CD8⁺T細胞表達TNFSF14和KDM5A增加，NK細胞表達KDM5A增加。

??延伸：
CD2AP 是CD4+T細胞的接頭分子，在病毒感染時參與濾泡輔助性T細胞Tfh的分化調(diào)節(jié)并促進保護性抗體的產(chǎn)生。
TNFSF14 促進T細胞活化和外周血T細胞招募到組織。
KDM5A 編碼的H3K4me3脫甲基酶是NK細胞和T細胞活化所需。

總結(jié)：Taken together, these results demonstrated that elevated plasma cells and increased activation of T cells and NK cells in COVID-19 patients may contribute to defense against the virus.

這一部分的分析如D圖和E圖直接挑出某些分子查看表達邏輯性不強，這樣做需要很多免疫學先驗知識。

3. COVID-19患者的IFN反應和淋巴細胞凋亡

圖A：對day1 COVID-19患者的T細胞、B細胞和NK細胞的高表達基因（和HC相比）進行功能富集，并展示了top20的富集通路。
??：這里是把T, B, NK三種細胞的富集分析結(jié)果各選了前20個pathhway一起展示的。因為有重復的通路，所以展示了42條通路。可以借鑒??
response to type I IFN signaling和defense response to virus signaling在T, B, NK細胞中都被顯著富集。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和蛋白去折疊相關(guān)通路在B細胞中被顯著富集。這可能是由于漿細胞比例增加，抗體合成旺盛所致。其他的信號通路包括染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)、DNA致密化改變等在SARS-CoV-2感染中也出現(xiàn)了上調(diào)。相關(guān)基因的功能值得進一步探究。
圖B：day1 COVID-19患者的T細胞、B細胞、NK細胞、DC和單核細胞的高表達基因（和HC相比）的火山圖顯示，和富集分析結(jié)果中response to type I IFN signaling被顯著富集相一致，對早期抗病毒起到關(guān)鍵作用的ISGs在多種細胞中都出現(xiàn)了顯著高表達。在這些ISGs中，ISG15, IFI44L, MX1 和 X-linked inhibitor of apoptosis (XIAP)-associated factor 1 (XAF1)在T, B, NK, DC細胞群中都出現(xiàn)了上調(diào)。
圖C：在bulk水平上進行比較，和HC相比，新冠患者樣本中上述4個基因也出現(xiàn)了明顯上調(diào)。

圖D：隨后作者將新冠患者從出現(xiàn)癥狀到出院人為分為了四個病程stage，并檢測了這些差異基因在病程中的轉(zhuǎn)錄動態(tài)變化。結(jié)果得到6個時間依賴性表達模塊。??這里的時間動力學聚類分析是用Mfuzz做的。(見Mfuzz)
圖E：對6個模塊中的基因進行了通路富集分析以探究其生物學意義
Cluster 3包含158個基因，這些基因隨著病程進展表達量逐漸降低。這些基因的功能富集顯示它們主要與IFN反應相關(guān)，提示這些ISG相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是動態(tài)變化的，它們在早期被激活以起到早期抗病毒作用，在晚期時間點表達活性逐漸降低。
Cluster 1包含38個基因，這些基因隨著病程進展表達量逐漸增加。GO富集顯示它們的功能主要與翻譯和蛋白合成相關(guān)通路有關(guān)。這與隨病程進展抗體合成增多相一致。
圖F：HC和COV的CD4+T細胞部分基因表達情況顯示TNFSF10 (TRAIL) 和它的受體TNFRSF10A在COV患者的T細胞中表達增加。另一個TNF通路成員TNFRSF1B在COV患者的T細胞也出現(xiàn)了表達上調(diào)。FAS, FASLG, 和FADD（FAS通路相關(guān)）也出現(xiàn)了上調(diào)。

4. COVID-19患者和IAV患者相比的免疫分子特征

圖A：比較了HC、COVID-19和IAV患者的CD4+T細胞的因子、細胞因子受體和轉(zhuǎn)錄因子表達變化(NK細胞和DC細胞的結(jié)果見supplement)。聚類結(jié)果顯示COVID-19患者的免疫細胞主要編碼促炎細胞因子、細胞因子受體和IFN-反應性轉(zhuǎn)錄因子。而IAV患者，促炎轉(zhuǎn)錄因子和virus-interacting host factors出現(xiàn)明顯高表達。
在IAV患者的多種免疫細胞中，和機體免疫反應相關(guān)的多種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子如STAT3, NFKB1和REL都出現(xiàn)了上調(diào)。NFKB1和REL編碼NF-kB異二聚體的活性亞單位。激活NF-kB信號通路對于固有免疫和適應性免疫的調(diào)節(jié)具有重要作用。
在新冠患者的活化CD4陽性T細胞中，應對干擾素時激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子STAT3表達顯著增加（其他細胞也增加，見supplement）。
圖B：此前有研究顯示STAT3信號通路的激活物IL-6和IL-10在IAV患者中高表達。圖B顯示和COVID-19和HC相比，HAV感染患者的活化的CD4+T細胞表達STAT3增加并且與time post admission相關(guān)。此外和其他組相比，HAV感染患者的活化的CD4+T細胞高表達RUNX3。既往文獻報道RUNX3 induction是CD4+T細胞獲得細胞毒性的關(guān)鍵步驟。
圖C：STAT3和IRF3的表達在COVID-19中都增加，STAT3和NFkB表達在IAV中增加。

Hightlights

• We generated a single-cell atlas of PBMCs in both COVID-19 and influenza patients
• Plasma cells increase significantly in both COVID-19 and influenza patients
• COVID-19 is featured with XAF1-, TNF-, and FAS-induced T cell apoptosis
• COVID-19 activates distinct pathway (STAT1/IRF3) versus influenza (STAT3/NFkB)