近日，法國斯特拉斯堡大學(xué)Michael Weber團隊通過多種實驗方法揭示了原始生殖細(xì)胞（Primordial Germ Cells, PGCs）中DNA甲基化重編程的抗性機制，重點闡明了UHRF2在PGCs中維持特定DNA甲基化模式中的關(guān)鍵作用，并探討了其對生殖細(xì)胞發(fā)育和功能的作用。研究結(jié)果表明，UHRF2在維持逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子甲基化、調(diào)節(jié)減數(shù)分裂基因表達和卵母細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。UHRF2缺失在雌性生殖細(xì)胞中導(dǎo)致減數(shù)分裂基因過表達和卵母細(xì)胞發(fā)育受損。相關(guān)研究成果以“UHRF2?mediates?resistance?to?DNA?methylation?reprogramming?in?primordial?germ?cells“為題發(fā)表于《Nature?Communications》期刊。

標(biāo)題：UHRF2?mediates?resistance?to?DNA?methylation?reprogramming?in?primordial?germ?cells（UHRF2介導(dǎo)原始生殖細(xì)胞對DNA甲基化重編程的抗性）

發(fā)表時間：2025年8月9日

發(fā)表期刊：Nature?Communications

影響因子：IF15.7/Q1

技術(shù)平臺：微量單細(xì)胞RRBS、RNA-seq、Target-BS等（易基因金牌技術(shù)）

DOI:10.1038/s41467-025-61954-0

哺乳動物的原始生殖細(xì)胞（PGCs）會經(jīng)歷全局性DNA去甲基化，但對生殖有關(guān)基因表現(xiàn)出延遲的去甲基化現(xiàn)象，并在進化上年輕的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子區(qū)域選擇性保留DNA甲基化。然而PGCs中DNA甲基化維持的分子機制尚不清楚。本研究首先揭示了DNMT1輔因子UHRF1的同源基因UHRF2是PGCs對DNA甲基化重編程抗性的關(guān)鍵調(diào)控因子。Uhrf2基因敲除小鼠的PGCs中表現(xiàn)出逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子DNA甲基化缺失，而體細(xì)胞中的DNA甲基化則不受影響。這與E13.5 PGCs中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達變化無關(guān)，表明在這一階段存在其他機制補償逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的調(diào)控。此外，Uhrf2缺失的PGCs表現(xiàn)出生殖有關(guān)基因的提前去甲基化，且在雌性中過表達減數(shù)分裂基因。隨后，Uhrf2缺失的小鼠表現(xiàn)出卵母細(xì)胞發(fā)育受損、雌性特有的生育力降低以及在精子發(fā)生中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子不完全再甲基化。這些發(fā)現(xiàn)揭示了UHRF1同源基因UHRF2在調(diào)控生殖譜系DNA甲基化中的關(guān)鍵功能。

研究方法

本研究通過多種實驗方法，包括小鼠模型構(gòu)建、微量單細(xì)胞DNA甲基化測序、流式細(xì)胞分選、RNA測序（RNA-seq）、免疫熒光實驗、組織學(xué)分析和生殖能力測試，全面揭示了UHRF2在PGCs中維持特定DNA甲基化模式中的關(guān)鍵作用。這些方法的綜合應(yīng)用為理解PGCs中的表觀遺傳調(diào)控機制提供了重要的實驗依據(jù)。

①?小鼠模型構(gòu)建：UHRF2基因敲除（knock-out, KO）小鼠模型和Dnmt1條件性敲除（conditional knock-out, cKO）小鼠模型。

②??微量單細(xì)胞甲基化測序（RRBS）：使用Oct4-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過流式細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)分離純化的PGCs。分析E9.5到E17.5不同發(fā)育階段的PGCs進行高深度測序，分析DNA甲基化動態(tài)變化。

③??RNA測序（RNA-seq）：從E8.5胚胎和E13.5 PGCs中提取總RNA，分析基因表達變化，特別是與DNA甲基化相關(guān)的基因表達。

④?免疫熒光實驗：通過免疫熒光技術(shù)檢測UHRF2蛋白在PGCs中的表達和定位。

⑤??組織學(xué)分析（Histology）：對卵巢和睪丸進行組織學(xué)分析，觀察UHRF2缺失對生殖細(xì)胞發(fā)育的作用。

⑥??生育能力測試：將UHRF2突變小鼠與野生型小鼠交配，觀察后代數(shù)量，評估生育能力。

⑦?其他實驗：LUMA檢測整體CpG甲基化水平。Bisulfite測序分析特定基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)。Western Blot檢測UHRF2和UHRF1蛋白表達。

結(jié)果圖形

（1）PGC發(fā)育過程中的DNA甲基化動態(tài)變化

研究通過RRBS技術(shù)，對小鼠PGCs從胚胎階段E8.5到E17.5的DNA甲基化進行了全面分析。分析結(jié)果表明，與上胚層相比，PGCs在E9.5時低甲基化，且在E10.5到E13.5期間發(fā)生全局性去甲基化。雄性PGCs從E14.5開始恢復(fù)全局甲基化，而雌性PGCs則保持低甲基化狀態(tài)。此外研究還發(fā)現(xiàn)，某些基因啟動子區(qū)域的去甲基化速率比全基因組慢，表明這些區(qū)域甲基化具有延遲性。這些結(jié)果為理解PGCs中DNA甲基化的動態(tài)變化提供了重要數(shù)據(jù)。

圖 1：DNMT1介導(dǎo)PGCs中的選擇性維持DNA甲基化 a. RRBS檢測E7.5上胚層（Epb）及PGC發(fā)育過程中的整體 CG 甲基化水平。樣本平均覆蓋的CpG位點數(shù)為CGI 的n=599,050 和non-CGI的n=560,437。 b. 三個生殖有關(guān)基因（Dazl、Tuba3b、Taf7l）的CG富集啟動子區(qū)域的RRBS甲基化圖譜，以及Etv6 對照基因外顯子序列的甲基化圖譜。 c. 與全基因組相比，PGCs 中生殖有關(guān)基因啟動子區(qū)域去甲基化動態(tài)變化。全基因組包括上胚層中甲基化>50% 及E13.5 PGCs中甲基化< 20%的所有CG中位數(shù)甲基化水平。 d. 與全基因組相比，雌性和雄性E13.5 PGCs 中殘留甲基化區(qū)域（RMRs）內(nèi)各CpG 位點甲基化水平（全基因組n=18,909,193個CpG位點，RMRs n=350,807個CpG位點）。 e. 雌性和雄性E13.5 PGCs 中 RMRs 的重疊維恩圖。 f. RMRs 中不同轉(zhuǎn)座元件（TE）家族的分布情況餅圖。 g. 與全基因組相比，E13.5 PGCs 中最高甲基化逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族的甲基化情況。箱線圖顯示在 WGBS或RRBS數(shù)據(jù)集中與每個逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族各拷貝重疊的各個 CpG 位點甲基化水平分布。平均而言，WGBS和RRBS數(shù)據(jù)集分別覆蓋69%和12%的基因組拷貝數(shù)。 h. E13.5 PGCs 中持續(xù)甲基化的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子WGBS 甲基化圖譜示例。 i. 通過RRBS對PGC發(fā)育過程中最高甲基化的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子家族CG甲基化水平進行定量分析。 j. 與同窩對照（WT）相比，Dnmt1條件性敲除（cKO）E13.5 PGCs RMRs 內(nèi)各個 CpG 位點的甲基化水平的箱線圖（WT n=35024個CpG位點，WT n=33610個CpG 位點，雜合子Het n=32389個CpG位點，Het n=31170個CpG位點，Het n=26439個CpG位點，Het n=23172個CpG位點，cKO n=27940個CpG位點，cKO n=24732個CpG位點）。 k. Dnmt1 條件性敲除和對照 E13.5 PGCs 中的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的 RRBS 甲基化圖譜示例。

（2）PGC中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對DNA去甲基化的位點特異性抗性

通過分析E13.5 PGCs的全基因組數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)了20,255個和19,262個殘留甲基化區(qū)域（Residually Methylated

Regions, RMRs），這些區(qū)域在逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中富集，尤其是年輕的LTR和非LTR逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（如ERVK、ERV1和L1Md家族）。這些逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在PGCs中表現(xiàn)出對去甲基化的抗性，其甲基化水平在PGCs發(fā)育過程中保持穩(wěn)定。通過條件性敲除Dnmt1基因，進一步證實了DNMT1在維持這些逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子甲基化中的關(guān)鍵作用。

（3）UHRF2在PGCs中維持DNA甲基化不可或缺

研究發(fā)現(xiàn)，UHRF2在PGCs中高表達，且其蛋白主要定位于細(xì)胞核。通過UHRF2基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)UHRF2缺失導(dǎo)致PGCs中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子甲基化丟失，而體細(xì)胞中的DNA甲基化則不受影響。這表明UHRF2在PGCs中維持特定DNA甲基化模式中發(fā)揮著不可或缺的作用。

圖2：Uhrf2在PGCs中的表達及Uhrf2基因敲除小鼠特征 a. 小鼠UHRF1和UHRF2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 b. 通過RNA-seq檢測Uhrf2、Uhrf1和Dnmt1基因在胚胎干細(xì)胞（ESCs）、E8.5胚胎以及雄性（m）和雌性（f）E13.5 PGCs中的表達。 c. 在表達Oct4-GFP的E13.5雌性或雄性性腺細(xì)胞中，對UHRF2進行免疫熒光分析。 d. 本研究中使用的Uhrf2基因敲除等位基因示意圖。 e. PND10 Uhrf2缺失小鼠和WT小鼠的脾臟和大腦中UHRF2和UHRF1蛋白Western blot分析。 f. 通過Uhrf2-/+×Uhrf2-/+（左）或Uhrf2L1/+×Uhrf2L1/+（右）雜交得到的8日齡幼崽的基因型分布。 g. Uhrf2與同窩野生型小鼠的產(chǎn)后存活曲線對比。 h. 與同窩小鼠相比，PND10時Uhrf2-/-小鼠出現(xiàn)生長遲緩的情況。 i. 與雜合子和野生型同窩小鼠相比，由Uhrf2雜合子父母交配得到的Uhrf2缺失小鼠（上）以及由 Uhrf2L1/+父母交配得到的 Uhrf2L1/L1 小鼠（下）體重對比。出生后第 8、15 和 21 天測量體重。? ?

圖3：Uhrf2對PGCs中的DNA甲基化至關(guān)重要，但對體細(xì)胞則不受影響 a.????? LUMA檢測的Uhrf2-/-小鼠與WT PND21小鼠大腦和肝臟中的整體CG甲基化水平。 b.???? 通過RRBS對Uhrf2-/-小鼠與WT PND21小鼠的大腦、肝臟和心臟中的CG甲基化進行定量分析。分別顯示了CpG島外（non-CGI）和CpG島內(nèi)（CGI）的CG甲基化水平。 c.????? 通過流式細(xì)胞術(shù)從Uhrf2突變小鼠與同窩WT E13.5胚胎的性腺中回收的PGCs數(shù)量（WT n=16個胚胎，Uhrf2-/- n=16，WT n=10，Uhrf2L1/L1 n=9）。 d.???? 將來自Uhrf2-/-和Uhrf2L1/L1小鼠的E13.5 PGCs與它們同窩WT胚胎進行比較RRBS CG甲基化評分在500bp窗口中的相關(guān)性。 e.????? 與WT E13.5 PGCs相比，Uhrf2-/-和Uhrf2L1/L1小鼠中雄性和雌性PGCs內(nèi)RMRs中各個CpG位點的甲基化水平箱線圖。 f.?????? 與WT E13.5 PGCs相比，Uhrf2-/-和Uhrf2L1/L1小鼠中雄性和雌性PGCs中ERV家族的平均甲基化水平。 g.???? Uhrf2突變和WT E13.5 PGCs中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的RRBS甲基化圖譜示例。

（4）Uhrf2介導(dǎo)的DNA甲基化對于原始生殖細(xì)胞（PGCs）中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的抑制并非必需

盡管UHRF2缺失導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的甲基化丟失，但RNA-seq分析結(jié)果揭示，其逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達并未顯著增加。這表明在PGCs中，DNA甲基化可能不是抑制逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的主要機制，其他表觀遺傳機制（如H3K9me3和H3K27me3）可能在維持逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子沉默中發(fā)揮補償作用。

圖4：Uhrf2失活導(dǎo)致E13.5 PGCs中減數(shù)分裂基因表達增加，但逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子表達未增加。 a.????? 火山圖顯示在雄性和雌性Uhrf2-/- E13.5 PGCs中轉(zhuǎn)座元件（TE）家族的差異表達。 b.???? 與WT E13.5 PGCs相比，Uhrf2-/-中Dnmt和Uhrf1基因的FPKM表達值。 c.????? 在雄性和雌性Uhrf2-/- E13.5 PGCs中鑒定出的顯著上調(diào)和下調(diào)基因數(shù)量。 d.???? 與WT E13.5 PGCs相比，Uhrf2-/-中多能性和生殖系身份調(diào)控因子的表達。圖例與b相同。 e.????? 在雌性Uhrf2-/- E13.5 PGCs中上調(diào)基因中顯著富集的GO分析。 f.?????? 與WT E13.5 PGCs相比，雌性Uhrf2-/-的差異基因表達火山圖。 g.???? Uhrf2-/-和Dnmt1-cKO E13.5 PGCs中上調(diào)基因重疊的維恩圖。 h.???? Uhrf2L1/L1與WT E11.5 PGCs相比，Tuba3b啟動子的目標(biāo)區(qū)域亞硫酸鹽測序分析。 i.?????? 通過免疫染色檢測STRA8（紅色核信號）來鑒定對照（WT）和突變E13.5胎兒卵巢切片中的減數(shù)分裂細(xì)胞。

（5）Uhrf2失活導(dǎo)致雌性PGCs中減數(shù)分裂基因過表達

RNA-seq分析顯示，UHRF2缺失的雌性PGCs中，許多減數(shù)分裂相關(guān)基因（如Stra8、Sycp1等）表達顯著上調(diào)。這些基因的過表達可能導(dǎo)致雌性PGCs提前進入減數(shù)分裂，進而影響卵子發(fā)育。免疫熒光實驗進一步證實UHRF2缺失的雌性PGCs中出現(xiàn)了更多的減數(shù)分裂標(biāo)志物陽性細(xì)胞。

（6）Uhrf2對卵母細(xì)胞發(fā)育的必要性

組織學(xué)分析顯示，UHRF2缺失的雌性小鼠卵巢中原始卵泡數(shù)量減少，且在生育能力測試中，UHRF2缺失的雌性小鼠生育能力顯著下降。這些結(jié)果表明，UHRF2在卵母細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

圖5：Uhrf2失活會損害卵母細(xì)胞發(fā)育和精子發(fā)生過程中的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子甲基化 a.????? H&E染色的PND80時野生型（WT）和Uhrf2-/-雌性小鼠卵巢的組織切片。 b.???? 在PND80的卵巢切片中，Uhrf2突變和WT同窩小鼠雌性的初級、次級和竇狀卵泡的數(shù)量。 c.????? 在PND15的卵巢連續(xù)切片中，Uhrf2L1/L1和WT同窩小鼠雌性的原始卵泡數(shù)量（左側(cè)）以及初級、次級和竇狀卵泡數(shù)量（右側(cè)）。 d.???? 與WT同窩對照組相比，Uhrf2缺失雌性小鼠所生的幼崽數(shù)量。 e.????? 用H&E染色的PND80時野生型（WT）和Uhrf2-/-雄性小鼠睪丸的代表性組織切片。 f.?????? PND80時Uhrf2缺失雄性小鼠與其同窩對照組的睪丸與體重比。Uhrf2L1/L1雄性小鼠與WT和Uhrf2L1/+雜合子進行了比較。 g.???? 與同窩對照組相比，Uhrf2缺失雄性小鼠交配所生的幼崽數(shù)量。 h.???? 在Uhrf2-/-與WT精子中，500bp范圍內(nèi)RRBS CG甲基化評分的相關(guān)性。 i.?????? 在Uhrf2缺失精子中鑒定出的與轉(zhuǎn)座元件（TEs）共定位的差異甲基化區(qū)域（DMRs）比例。 j.?????? 與WT精子相比，Uhrf2缺失精子中選定的ERV和L1家族的平均甲基化水平。 k.????? 在Uhrf2缺失PGCs和精子中低甲基化的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列的兩個示例。

（7）Uhrf2 失活會損害精子發(fā)生過程中的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子再甲基化

在雄性生殖細(xì)胞中，UHRF2缺失導(dǎo)致精子中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子低甲基化。盡管如此，UHRF2缺失的雄性小鼠仍能產(chǎn)生功能正常的精子并保持生育能力。這表明UHRF2在精子發(fā)生過程中對逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的再甲基化具有重要作用，但并非絕對必要。

討論和啟示

本研究揭示了UHRF2在PGCs中維持特定DNA甲基化模式中的關(guān)鍵作用。UHRF2可能通過與DNMT1協(xié)同，維持逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的甲基化，防止?jié)撛谟泻υ募せ睢４送?，UHRF2在調(diào)節(jié)減數(shù)分裂基因表達和卵子發(fā)育中也發(fā)揮重要作用。盡管UHRF2缺失對雄性生殖細(xì)胞的作用不明顯，但在雌性生殖細(xì)胞中，UHRF2缺失導(dǎo)致減數(shù)分裂基因過表達和卵子發(fā)育損害。這些發(fā)現(xiàn)為理解PGCs中的表觀遺傳調(diào)控機制提供了新的見解，并為未來的研究提供了新的方向。

微量單細(xì)胞甲基化測序分析的作用

微量單細(xì)胞甲基化測序技術(shù)在本研究中發(fā)揮了重要作用。通過微量RRBS技術(shù)，研究者能夠高分辨率地分析PGCs在不同發(fā)育階段的DNA甲基化動態(tài)變化，揭示全基因組去甲基化和特定區(qū)域的甲基化抗性。這種技術(shù)不僅提供了詳細(xì)的甲基化圖譜，還幫助研究者發(fā)現(xiàn)了UHRF2在維持特定DNA甲基化模式中的關(guān)鍵作用。未來，微量單細(xì)胞甲基化測序技術(shù)有望在更多類似研究中應(yīng)用，特別是在探索表觀遺傳調(diào)控機制和細(xì)胞命運決定中的研究和應(yīng)用。

參考文獻：

Bender A, Morel M, Dumas M, Klopfenstein M, Osmani N, Greenberg MVC,Bourc'his D, Ghyselinck NB, Weber M. UHRF2 mediates resistance to DNAmethylation reprogramming in primordial germ cells. Nat Commun. 2025 Aug9;16(1):7350. doi: 10.1038/s41467-025-61954-0.