全基因合成是指在體外利用人工方法合成雙鏈DNA分子的技術(shù)?；蚝铣蔁o需模板，是獲取基因的重要手段之一。目前該技術(shù)主要應(yīng)用在克隆一些不易獲取模板的基因、自然界不存在的新基因以及異源基因表達(dá)上，經(jīng)常在對(duì)基因密碼子優(yōu)化后進(jìn)行。密碼子優(yōu)化的必要性及方法，已經(jīng)在前面的文章中介紹，想要回顧的點(diǎn)這里密碼子優(yōu)化。
全基因合成技術(shù)很成熟，一般的做法是：設(shè)計(jì)合成相互重疊的單鏈寡核苷酸，通過重疊延伸PCR法拼接出全長。關(guān)于全基因合成方法的資料網(wǎng)上一大堆，單全基因合成的相關(guān)專利都上百篇，常見的有重疊延伸PCR（OE-PCR）法[1,7]，雙不對(duì)稱PCR（DA-PCR）法[2]，聚合酶連反應(yīng)（PCR）法[3]，連接酶鏈反應(yīng)（LCR）法[4]，熱力學(xué)平衡由內(nèi)向外（TBIO）法[5]，PCR介導(dǎo)兩步（PTDS）法[6]。說實(shí)話我并沒有仔細(xì)研究這些方法，它們叫什么名字不重要，萬變不離其宗：PCR，基于一定重疊的短引物通過聚合酶逐漸延伸成長片段。
全基因合成最簡單的方法是什么？
當(dāng)然是讓DNA合成公司來合成，我們只需要提供DNA序列信息，他們會(huì)合成dsDNA并克隆在通用載體上，一般還提供測(cè)序信息，確保合成的正確性。這無疑是最簡單、最省事的方法。而且現(xiàn)在全基因合成十分廉價(jià)，1bp不到一塊錢還帶測(cè)序的那種。
既然DNA合成公司那么方便，為什么還要自己合成呢？
① 公司合成慢，一般需要1-2周，如果碰到特殊序列比如對(duì)大腸桿菌毒性極大的編碼序列，那周期就難說了（我做過一個(gè)核酸酶，合成公司一個(gè)月沒搞定，自己合成一周搞定）。
② 不自由，合成公司提供的一般是攜帶目標(biāo)基因的重組載體，拿到后還要用酶切切下來，如果基因內(nèi)部含有酶切位點(diǎn)還需要避開，當(dāng)然這些一般不是什么大問題，但你確實(shí)沒得選。
③ 如前所述，全基因合成一般用于異源基因表達(dá)，異源表達(dá)的對(duì)象大多是酶，研究酶的性質(zhì)可能又需要構(gòu)建大量突變體。合成公司只提供一個(gè)序列，構(gòu)建突變體還得自己設(shè)計(jì)引物重新構(gòu)建，如果自己合成全基因，只需要將包含突變的引物替換掉，就可以同時(shí)獲得各類突變體，這在構(gòu)建含大量突變的突變體時(shí)，更有優(yōu)勢(shì)。
④ 序列需要保密，畢竟自己才最可靠。
總有人喜歡自己動(dòng)手豐衣足食，本文我要介紹的是自己合成的方法，介紹兩種方法：
1 基于“搭橋”PCR的一次拼接法
這種方法依賴于引物間的相互退火，彼此作為模板相互延伸，因此需要的引物總是一正一反。首先把全基因序列打斷為短的oligos，一般不大于59bp，因?yàn)橐话阋锖铣梢?9bp為分水嶺，超過59bp價(jià)格和時(shí)間成本都會(huì)高很多。oligos靠3'末端互補(bǔ)序列相互退火，形成帶有g(shù)aps的雙鏈產(chǎn)物，再由DNA聚合酶補(bǔ)齊gaps，形成帶有切刻的DNA雙鏈，這種產(chǎn)物經(jīng)過Taq DNA Ligase鏈接形成完整的雙鏈產(chǎn)物，依此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可得到目標(biāo)基因，也可以直接使用帶有切刻的DNA雙鏈作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
2 基于逐漸延伸的step by step法
這種方法僅最后一條引物為反向，其余均為正向，正向引物間具有重疊序列。倒數(shù)第一條oligo與倒數(shù)第二條oligo靠末端互補(bǔ)序列相互退火，經(jīng)過第一次PCR循環(huán)，雙鏈延長，延長的雙鏈與倒數(shù)第三條oligo繼續(xù)退火、延長，......，依此類推，直至全長序列合成。這種方法理論上一次PCR循環(huán)只能延伸一條引物，N條oliogs就至少需要經(jīng)過N個(gè)PCR循環(huán)，由于只有一個(gè)延伸端，引物設(shè)計(jì)比方法1簡單，而且引物數(shù)目不需要必須為偶數(shù)。
全基因合成一般步驟
⒈ 設(shè)計(jì)PCR引物
可以借助自動(dòng)設(shè)計(jì)工具也可以人工設(shè)計(jì)，借助工具后面會(huì)詳細(xì)介紹。如果人工設(shè)計(jì)，推薦使用SnapGene（這款軟件的強(qiáng)大就不多說了，搞分子生物學(xué)應(yīng)該都知道，網(wǎng)上有很多破解版，沒安裝的話自己去百度一個(gè)吧），將全基因序列復(fù)制進(jìn)去之后，先調(diào)出“Preferences”面板，找到“Primer”選項(xiàng)，把3’端最短匹配長度和最低Tm分別設(shè)置為10bp和40℃，這樣當(dāng)你添加引物時(shí)軟件就會(huì)自動(dòng)提醒有沒有次級(jí)結(jié)合位點(diǎn)（如下圖）。
因?yàn)?’端錯(cuò)配對(duì)本文中的全基因合成方法十分不利，如果這兩個(gè)設(shè)置太低實(shí)在難以設(shè)計(jì)出引物，可以適當(dāng)調(diào)高至12bp和45℃，還不行的話只能優(yōu)化密碼子后再重新設(shè)計(jì)。
引物的長度預(yù)設(shè)為59bp，重點(diǎn)是重疊區(qū)的設(shè)計(jì)，一般應(yīng)該根據(jù)重疊區(qū)的Tm來確定，不同重疊區(qū)之間的Tm平衡很重要，一般?Tm不超過3℃，推薦把Tm設(shè)置在55-58℃之間。需要注意的是，針對(duì)本文的方法一，引物數(shù)目必須是偶數(shù)，從序列開頭往后一條一條的拉，下一條oligo的起點(diǎn)是上一條的終點(diǎn)-重疊區(qū)，上正下反，如果最后為奇數(shù)條，要調(diào)整最后幾條長度，補(bǔ)出一條反向引物。
針對(duì)方法二，從序列開頭拉一條正向，剩余全部為反向直到末尾，也可以從末尾拉一條反向，剩余為正向直到開頭，這種方法不用管引物數(shù)目。
⒉ PCR獲得全長產(chǎn)物
一般需要兩輪PCR。第一輪，加入少量引物，推薦50uL體系中0.5-1pmol/個(gè)oligo，10-15個(gè)循環(huán)，獲得全長模板，本輪PCR推薦使用的DNA聚合酶應(yīng)該同時(shí)缺失3’-5’和5’-3’外切酶活性，這兩種活性會(huì)損傷重疊區(qū)的Tm平衡；第二輪，取1uLPCR產(chǎn)物做模板，加入20pmol全長上下游引物，20-25個(gè)循環(huán)獲得目標(biāo)基因，本輪PCR應(yīng)使用高保真DNA聚合酶。
⒊ 克隆至表達(dá)載體
通過同源重組，酶切鏈接等方法將目標(biāo)基因插入載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌或其他宿主感受態(tài)細(xì)胞，獲取單克隆子。提示：在全基因合成前，一定要針對(duì)克隆/表達(dá)載體設(shè)計(jì)好同源臂或者酶切位點(diǎn)，直接加在全基因序列上，否則還要單獨(dú)設(shè)計(jì)引物添加同源臂或者酶切位點(diǎn)。
⒋ 測(cè)序鑒定
菌體PCR鑒定陽性克隆子并挑選陽性克隆子測(cè)序，正確的克隆可用于下游的表達(dá)和純化。
在線設(shè)計(jì)工具
OPTIMIZER：http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/，這是一個(gè)非常優(yōu)秀的在線設(shè)計(jì)工具，集密碼子優(yōu)化和全基因合成于一身，不過他生成的oligo只能是50、55、60等5的整倍（60就很尷尬了），而且它不檢查引物條數(shù)，最后一條可能形成錯(cuò)配，這可以通過再設(shè)計(jì)額外的全長引物彌補(bǔ)。不過我現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)打不開了，不知道是我的網(wǎng)絡(luò)問題還是網(wǎng)址/服務(wù)器出了問題。
DNA Works[8]：這個(gè)工具來源于《Nucleic Acids Research》，論文中的連接失效了，這是我新找到的連接：https://hpcwebapps.cit.nih.gov/dnaworks/，也支持密碼子優(yōu)化，不過我覺得不是太好用，參數(shù)太多有點(diǎn)復(fù)雜了。
Gene2oligo[9]：也來源于《Nucleic Acids Research》，它設(shè)計(jì)的引物之間是沒有空隙（gaps）的，論文中的連接也失效了（原來的鏈接：http://berry.engin.umich.edu/gene2oligo），我也沒找到新的。
Assembly PCR Oligo Maker[10]：來源于《Nucleic Acids Research》，論文中的鏈接為： http://publish.yorku.ca/~pjohnson/AssemblyPCRoligomaker.html，我還是打不開（我都快哭了）。
GeMS[11]：來源于《Nucleic Acids Research》，這是一個(gè)軟件套件，功能很多，鏈接是：http://software.kosan.com/GeMS，打不開。
GeneDesign[12]：來源于《Genome Research》，論文中的鏈接是：http://slam.bs.jhmi.edu/gd，但依然打不開，從論文內(nèi)容看與我的工具比較像，也根據(jù)Tm計(jì)算重疊區(qū)，可惜沒辦法看到源碼。
gene2oligos：http://www.liuzhen106.com/tools/104.html，這個(gè)一定打得開，這是我自己寫的工具，包括密碼子分析與優(yōu)化，將基因自動(dòng)轉(zhuǎn)化為oligos，生成參考實(shí)驗(yàn)方案三個(gè)功能。生成的oligos，具有統(tǒng)一長度，重疊區(qū)具有相同的Tm值，Tm計(jì)算公式為：Tm = 64 + 0.41×GC - 528/n，怎么來的參考我的《PCR引物設(shè)計(jì)大法》。生成的oligos可以，一鍵復(fù)制，格式為oligo+序列編號(hào)+空格+Tab+序列(5’-3’)，可以直接導(dǎo)入SnapGene。
引物設(shè)計(jì)原則
長度：40-59bp，原則上引物長度即不能太短也不能太長。太短可能重疊區(qū)不夠，無法達(dá)到Tm均衡，而且oligos之間空隙很短或者沒有空隙，這樣相當(dāng)于對(duì)目標(biāo)基因全覆蓋，比較耗費(fèi)堿基。引物越長，gaps越大，更節(jié)省堿基，但引物越長，引物合成越困難，我在《引物合成原理及純化方式選擇》一文中介紹過，引物越長副產(chǎn)物越多，如果沒有高規(guī)格的純化方式，可能會(huì)導(dǎo)致增高的非特性拼接概率。有些文獻(xiàn)喜歡用40-46nt的引物，本文優(yōu)先考慮長堿基，畢竟節(jié)儉堿基嘛。利用本文的方法，一般需要合成的總堿基數(shù)是全長序列的1.5倍，按照普通引物合成的價(jià)格，能夠比合成公司節(jié)約將近40%的成本
重疊區(qū)：在oligos相互退火時(shí)，引物間的結(jié)合是同時(shí)發(fā)生的，因此重疊區(qū)的Tm均衡就十分重要，如果某些oligo的Tm過低，退火時(shí)不易與其它oligos結(jié)合可能導(dǎo)致缺失，如果Tm過高，可能形成穩(wěn)定的中間片段，不利于獲得全長模板。
3’端錯(cuò)配：針對(duì)本文所述的兩種方法，3’端的錯(cuò)配可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的產(chǎn)物，比如有1-6條oligo，原本應(yīng)該按順序連接起來，如果引物1和4末端存在互補(bǔ)序列，那么就可能形成縮短產(chǎn)物，而且這種產(chǎn)物在第二輪PCR中往往被優(yōu)先擴(kuò)增，這會(huì)影響下游實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然有時(shí)某些引物的3’端可能存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，尤其是高GC的序列，可能不得不存在幾個(gè)錯(cuò)配堿基。那么這個(gè)3’端錯(cuò)配長度是多少才能使用呢？當(dāng)然這個(gè)沒有絕對(duì)界限，比如按Tm計(jì)算比完整重疊區(qū)的Tm低20℃，實(shí)際上這也是降低了錯(cuò)配的概率，我在以前的文章中解釋過Tm的意義，Tm為40℃的序列不是說在50℃就完全不退火了，實(shí)際上仍然有一部分退火，只不過比例很低。如果使用長度來界定，8-10bp是一個(gè)常用的標(biāo)準(zhǔn)。此外，引物3’端對(duì)PCR延伸效率也很重要，有研究認(rèn)為最后一個(gè)堿基最好為G/C，因此這一點(diǎn)也需要考慮。
引物條數(shù)：一般，我們想要盡可能少的使用引物，那么只能使用盡可能長的引物。至于引物數(shù)目是不是必須為偶數(shù)，這跟方法有關(guān)系，依靠一正一反相互延伸的，理論上需要偶數(shù)條，如果最后一條為奇數(shù)條，一般需要調(diào)整前面的引物長度，再補(bǔ)出一條反向引物。
驗(yàn)證設(shè)計(jì)效果
我的程序輸出的引物可以被SnapGene識(shí)別，菜單欄點(diǎn)擊“Primer”工具，點(diǎn)擊”Import Primer from a List“選項(xiàng)，選擇從剪貼板導(dǎo)入序列，
可以查看個(gè)引物是否完全覆蓋目標(biāo)序列，引物的“頭尾“是否沖突等等。
以GFP為目標(biāo)序列測(cè)試一下：
①從NCBI上找到GFP的序列，粘貼到文本框中，首先分析密碼子偏性；
大腸桿菌的稀有密碼子用紅色標(biāo)出，可見GFP原生基因中含有很多稀有密碼子，可以先執(zhí)行密碼子優(yōu)化。
②生成oligos，有兩種方式，默認(rèn)為方法一，如果引物見相似性高，會(huì)提示使用方法二。
點(diǎn)擊生成oligos按鈕后，會(huì)彈出總堿基數(shù)的統(tǒng)計(jì)信息，然后輸出oliogs序號(hào)及序列，同時(shí)生成實(shí)驗(yàn)方案按鈕和復(fù)制按鈕，一鍵復(fù)制后可導(dǎo)入SanpGene分析。
③SanpGene分析
完全覆蓋了GFP的基因，并且為偶數(shù)條引物，引物間的Tm基本一致（由于程序與SnapGene的Tm算法不一致，在SnapGene上只能看到基本一致。
④生成實(shí)驗(yàn)方案
體外全基因合成一般一次不超過1000bp，一次性合成太長會(huì)增加出錯(cuò)的概率，我推薦按800bp分段，程序會(huì)根據(jù)你輸入的序列長度推薦分段數(shù)。
希望這個(gè)工具能幫到你完成全基因合成，我還寫了輔助載體構(gòu)建的工具，以后有機(jī)會(huì)再介紹。
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