對(duì)于科研工作者而言，我想“實(shí)驗(yàn)方案”這四個(gè)字應(yīng)該不會(huì)感到陌生吧！對(duì)于課題實(shí)驗(yàn)而言，一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)方案是成功的關(guān)鍵因素，會(huì)起到事半功倍的效果。雖然只有簡(jiǎn)短的四字，但有時(shí)候卻讓人焦頭爛額，不知道從何入手。小編不才，借此機(jī)會(huì)簡(jiǎn)要的理一下思路，拋磚引玉。如有“大牛”經(jīng)過，煩請(qǐng)指點(diǎn)一二。
目前，生物醫(yī)學(xué)方向的研究熱點(diǎn)依然逃脫不了miRNA、lncRNA以及circRNA三大系列，絕大部分都是與癌癥或腫瘤有關(guān)聯(lián)，在人體內(nèi)的作用機(jī)制還沒有得到完整的闡述，有待進(jìn)一步的深入研究。接下來本文以miRNA為例，來設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案。
【隨便選取一個(gè)miRNA以及某種癌癥】----以miRNA-142-5p和肺癌為關(guān)鍵詞。
一、明確研究對(duì)象：miRNA-142-5p，肺癌。
有了這兩個(gè)對(duì)象還不夠，還缺少一個(gè)重要的因素，那就是miRNA-142-5p的靶基因，因?yàn)閙iRNA一般都是通過作用靶基因來作用于癌癥。
1、靶基因預(yù)測(cè)
通過靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站，我們得知miRNA-142-5p的靶基因有很多，這時(shí)小伙伴們是不是有個(gè)疑惑，這么多靶基因，我該選哪個(gè)呢？不要慌，小編教你一個(gè)方法：因?yàn)橹黝}是與癌癥腫瘤相關(guān)，因此我們可以查找與cancer/tumor相關(guān)的靶基因。通過刷選，我們得知miRNA-142-5p的靶基因?yàn)镕AT3、TP53INP1和TNFAIP3。
【靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站：
microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/home.do)
和TargetScan (http://www.targetscan.org/vert_61/)】
2、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)——驗(yàn)證預(yù)測(cè)的靶基因
二、對(duì)象明確后，接下來就要開始進(jìn)入正題了。。（實(shí)驗(yàn)方法）
一般而言，與腫瘤或癌癥相關(guān)的實(shí)驗(yàn)方法包括三部分：臨床實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（小鼠造模）。
臨床試驗(yàn)
選取肺癌組織及其鄰旁健康組織（對(duì)照組），通過RT-qPCR檢測(cè)組織內(nèi)miRNA-3156-5p的表達(dá)，以觀察miRNA-142-5p在肺癌組織中是高表達(dá)還是低表達(dá)。
細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
1、細(xì)胞系
肺癌細(xì)胞系：H460、A549、HCC827、H1975和H1299；正常肺上皮細(xì)胞系：BEAS-2B和HBE。采用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。
2、VZET和EMT相關(guān)基因的表達(dá)情況分析
在肺癌細(xì)胞系和正常的肺上皮細(xì)胞系中利用RT-qPCR 和Western blot檢測(cè)miRNA-142-5p、FAT3、TP53INP1和TNFAIP3等相對(duì)表達(dá)量。
3、轉(zhuǎn)染
以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞/正常的肺上皮細(xì)胞為轉(zhuǎn)染對(duì)象，轉(zhuǎn)染miRNA-142-5p（實(shí)驗(yàn)組）【實(shí)驗(yàn)組分為miRNA-142-5p過表達(dá)組（pc-miRNA-142-5p）和敲低組（siRNA）】，陰性對(duì)照組（siNC、pcNC)，以及空白對(duì)照組
【分為5組：siRNA、pc -miRNA、siNC、pcNC、Control group】。
其中關(guān)于敲低/沉默組（siRNA），可以設(shè)計(jì)兩到三條對(duì)應(yīng)siRNA序列。
4、RT-qPCR和Western-blot
檢測(cè)轉(zhuǎn)染miRNA-142-5p后靶基因（FAT3、TP53INP1和TNFAIP3）的表達(dá)情況。
5、轉(zhuǎn)染后要檢測(cè)miRNA-142-5p對(duì)細(xì)胞的影響，論文中常見的一些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)包括細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡、自噬等，但各自采用的方法卻不一樣，接下來就簡(jiǎn)單的介紹一下：
細(xì)胞增殖——MTT/MTS/CCK-8等實(shí)驗(yàn)；
細(xì)胞遷移和侵襲——Transwell實(shí)驗(yàn)/劃痕愈合實(shí)驗(yàn)；
細(xì)胞凋亡——流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期、Caspase3/7活性檢測(cè)、ROS（活性氧）檢測(cè)、MMP（線粒體膜電位）檢測(cè)等；
細(xì)胞自噬——通過免疫組化/western-blot檢測(cè)自噬相關(guān)標(biāo)志物（LC3和Beclin-1）的相對(duì)表達(dá)量。
6、相關(guān)信號(hào)通路分析——細(xì)胞凋亡和自噬過程都是伴隨著相關(guān)的信號(hào)通路（singling pathway）。
Caspase-3/Caspase-9?singling pathway：
細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的一種方法，Caspase-3/-9是細(xì)胞凋亡的兩個(gè)關(guān)鍵成員。凋亡相關(guān)因子包括Caspase-3，Caspase-9，Bcl-2和Bax。Western-blot和RT-qPCR檢測(cè)對(duì)應(yīng)的蛋白或mRNA：Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax。
PI3K/Akt/mTOR singling pathway：
PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在腫瘤中研究較多。在轉(zhuǎn)染miRNA-142-5p后，結(jié)合相關(guān)通路抑制劑或激活劑（PI3K的抑制劑：LY294002；mTOR抑制劑：雷帕霉素（RAP）；PI3K/Akt/mTOR通路的激活劑：胰島素insulin），通過western-blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)量，包括Akt、p-Akt（磷酸化）、mTOR、p-mTOR。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
成瘤實(shí)驗(yàn)（Tumor formation assay）——小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證】
從肺癌細(xì)胞系中找出miRNA-142-5p表達(dá)最低的那個(gè)細(xì)胞系，然后過表達(dá)miRNA-142-5p；或者找出miRNA-142-5p表達(dá)最高的那個(gè)細(xì)胞系，然后進(jìn)行RNAi技術(shù)，敲低/沉默miRNA-142-5p。
轉(zhuǎn)染的細(xì)胞通過皮下注射到BALB/c裸鼠中，15 d左右后，處死小鼠，收獲腫瘤并測(cè)量腫瘤的重量及大小。
理論上講，實(shí)驗(yàn)方法越多，內(nèi)容越飽滿，相對(duì)而言越容易發(fā)高分的文章，當(dāng)然，這還得考慮個(gè)人實(shí)際情況，尤其是基金的預(yù)算以及您想要發(fā)幾分的文章，不可盲目。。。
關(guān)于幾分的文章對(duì)應(yīng)哪些實(shí)驗(yàn)方案，在這里小編簡(jiǎn)單的介紹一下：
0-1分：
單個(gè)細(xì)胞系，單組轉(zhuǎn)染miRNA（根據(jù)細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)情況來確定是過表達(dá)還是敲低轉(zhuǎn)染），做一些簡(jiǎn)單的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)即可（細(xì)胞增殖、遷移/侵襲、細(xì)胞凋亡--流式細(xì)胞檢測(cè)凋亡率）。
1-3分：
臨床組織樣本和多個(gè)細(xì)胞系（2-3個(gè)），單組轉(zhuǎn)染miRNA（根據(jù)細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)情況來確定是過表達(dá)或者敲低轉(zhuǎn)染），豐富相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，比如說細(xì)胞凋亡，除了利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率之外，還可以檢測(cè)細(xì)胞周期、Caspase3/7活性、MMP檢測(cè)、ROS檢測(cè)等。
3-5分：
臨床組織樣本和多個(gè)細(xì)胞系（3-5個(gè)）；兩種miRNA轉(zhuǎn)染形式：過表達(dá)和敲低/沉默（其中siRNA可以設(shè)計(jì)2-3條對(duì)應(yīng)序列）；研究相關(guān)信號(hào)通路以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（小鼠成瘤）驗(yàn)證miRNA的作用。
5-7分：
這算是一個(gè)高分文章了，所以思路相對(duì)要變一點(diǎn)，不能按照傳統(tǒng)模式下去。與5分以下文章相比，除了一些常規(guī)的研究之外，具有一個(gè)很重要的創(chuàng)新點(diǎn)：利用生信分析——基因表達(dá)微陣列（Gene expression microarray assay）檢測(cè)腫瘤組織與鄰近正常組織差異表達(dá)的miRNA和基因，通過表達(dá)以及敲除/沉默兩種手段進(jìn)行轉(zhuǎn)染miRNA或相對(duì)應(yīng)的基因。除此之外，在細(xì)胞系以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法的選擇上也更多，以及相關(guān)的信號(hào)通路研究和小鼠成瘤驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)也是必不可少的。
不管您發(fā)幾分的文章，有幾個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)是必不可少的，第一個(gè)就是靶基因的預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)；第二個(gè)就是RT-qPCR和western-blot，檢測(cè)相關(guān)mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
好了，今天小編就先介紹到這里了，如果您有什么想法或者問題，歡迎留言或者直接聯(lián)系溝通哦?。。?/p>
許多關(guān)注nambou1 W信公眾號(hào)的朋友都解決了自己在論文發(fā)表方面的困惑，順利的發(fā)表了論文，你不去關(guān)注一下？
公眾號(hào)回復(fù)：scihub 獲取最新版SciHub下載工具 免費(fèi)下載科學(xué)文獻(xiàn)
歡迎關(guān)注官方公眾號(hào)，還有更多實(shí)用工具等你來拿
免費(fèi)求助熱線: 400-080-3779
