利用流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡（Apoptosis） Annexin V/PI染色法
2020/06/0240392
工作原理：
正常細(xì)胞的表面由不對稱分布在質(zhì)膜內(nèi)葉和外葉上的脂質(zhì)組成。這些脂質(zhì)之一磷脂酰絲氨酸（PS），通常僅分布于質(zhì)膜的內(nèi)葉，因此僅暴露于細(xì)胞質(zhì)中。然而，在細(xì)胞凋亡過程中，脂質(zhì)不對稱性消失并且PS暴露在質(zhì)膜的外部小葉上。 Annexin V是一種36 kDa的鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能夠與PS結(jié)合。因此，熒光標(biāo)記的Annexin V可用于檢測暴露于早期凋亡細(xì)胞外部的PS。Annexin V還可以染壞死細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞的膜破裂，使Annexin V可以進(jìn)入整個質(zhì)膜，但是Annexin V就無法區(qū)分壞細(xì)胞死（中晚期凋亡細(xì)胞）和早期凋亡細(xì)胞。因此，通過與碘化丙啶（PI）共染色，可以將凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞（中晚期凋亡細(xì)胞）區(qū)分開，因?yàn)樵缙诘蛲黾?xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整，PI能進(jìn)入壞死細(xì)胞（中晚期凋亡細(xì)胞）但是被早期凋亡細(xì)胞排除在外。該方案描述通過Annexin V結(jié)合和PI攝取，然后通過流式細(xì)胞儀檢測和量化凋亡細(xì)胞。
Annexin V/PI染色方法：
1）根據(jù)細(xì)胞類型，選擇合適的細(xì)胞板接種培養(yǎng)目的細(xì)胞；
2）用細(xì)胞毒性刺激物處理細(xì)胞或通過紫外線輻射觸發(fā)貼壁細(xì)胞死亡，使用明場顯微鏡觀察細(xì)胞；
3）收集細(xì)胞，將1 × 105個細(xì)胞重懸于200μL Binding Buffer中，加入4μL 0.5 mg/mL PI和2μL Annexin V-FITC溶液；
4）避光室溫孵育15min；
5）用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測。（Annexin V-FITC最大激發(fā)光為488 nm，發(fā)射光為520 nm。PI最大激發(fā)光為～535 nm，發(fā)射光為 617 nm。 但是，兩者都可以被488 nm激光激發(fā)。）
流式細(xì)胞術(shù)檢測：
通過Annexin V結(jié)合和PI攝取來測量細(xì)胞死亡。（A）以漫畫形式描述凋亡細(xì)胞Annexin V結(jié)合和PI攝取。（i）磷脂酰絲氨酸（PS）位于活細(xì)胞完整質(zhì)膜的內(nèi)部小葉上，這些細(xì)胞不會被Annexin V和PI染色。（ii）PS翻轉(zhuǎn)到凋亡細(xì)胞質(zhì)膜的外部小葉，這些細(xì)胞在外部結(jié)合Annexin V，但仍不被PI染色。（iii）繼發(fā)性壞死細(xì)胞（中晚期凋亡細(xì)胞）膜破裂， Annexin V與質(zhì)膜上的PS結(jié)合，PI被吸收并與DNA結(jié)合。（B）在流式數(shù)據(jù)的點(diǎn)圖中（左側(cè)）以及在用放線菌素D（1μM）處理16 h并用Annexin V染色的U937細(xì)胞的點(diǎn)圖中觀察到i，ii和iii中的種群的地方Annexin V-FITC和PI（右側(cè)）。
實(shí)驗(yàn)過程中的小建議（大作用）：
1） 要準(zhǔn)備陰性對照（不加染料）、陽性對照（同時加兩種染料）和單染樣品（分別只加一種染料），陽性對照和單染樣品細(xì)胞可以55℃水浴10min或用凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
2） 細(xì)胞凋亡檢測的是活細(xì)胞，切勿用甲醛固定，盡量避免酶消化時間過長或用力吹打產(chǎn)生細(xì)胞碎片，重懸細(xì)胞后盡快上機(jī)檢測。
3） Annexin V的結(jié)合依賴于鈣離子，所以消化液中避免含有EDTA，否則會影響Annexin V與PS的結(jié)合。
4） Annexin V的結(jié)合不穩(wěn)定，所以需要在標(biāo)記時確保使用含鈣離子的緩沖液，并且在半小時內(nèi)上機(jī)檢測。
5） 如果細(xì)胞本身表達(dá)GFP或轉(zhuǎn)染了表達(dá)GFP的質(zhì)粒，就會干擾FITC熒光信號，需選擇其他熒光標(biāo)記的Annexin V，如Annexin V-PE，并且染色過程注意避光操作。
舉個例子：
1）
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右上象限（晚期凋亡）和右下象限（早期凋亡）中的H9c2細(xì)胞是凋亡細(xì)胞。上圖數(shù)據(jù)中表明，LPS組中H9c2細(xì)胞的凋亡率為27.5±0.56％，與對照組相比顯著增加（P <0.05）。 此外，在LPS + Gfi-1組中，轉(zhuǎn)染Gfi-1后，LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡率降低了（12.3±0.37％），與LPS組的凋亡率相比明顯降低（P <0.05）。 這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明Gfi-1能減弱LPS誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡。
文獻(xiàn)鏈接：*****DOI: 10.1007/s10753-019-01095-x*
2）
流式細(xì)胞儀分析用奧沙利鉑（抗腫瘤藥）處理48 h的HGC-27細(xì)胞在有或沒有轉(zhuǎn)染miR-374a-5抑制劑的時下細(xì)胞凋亡情況。上圖數(shù)據(jù)表明，與對照組（4.69％±0.24％）相比，抑制miR-374a-5p明顯誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡（9.42％±0.85％）。（Mock：未處理細(xì)胞；INC：抑制劑陰性對照；inhibitor：miR-374a-5p 抑制劑）
文獻(xiàn)鏈接：DOI:10.1016/j.omth.2019.07.025**
3）
Annexin V
凋亡樣本兩色分析測定數(shù)據(jù)。右下象限中的細(xì)胞處于凋亡早期，右上象限中的細(xì)胞處于凋亡晚期，通常在測定時主要關(guān)注這兩個象限。（A）用抗Fas抗體（未用PI染色）處理過夜的Jurkat細(xì)胞。（B）Jurkat細(xì)胞用抗Fas抗體處理過夜，并用PI染色。（C）Jurkat細(xì)胞用抗Fas抗體處理過夜并用Annexin V染色。（D）Jurkat細(xì)胞用抗Fas抗體處理過夜并用Annexin V和PI染。（E）除了在1mM EDTA存在下進(jìn)行染色以外，其他與D相同，說明EDTA影響了Annexin V與PS結(jié)合。
文獻(xiàn)鏈接：DOI: 10.1101/pdb.top093773**
參考文獻(xiàn)
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4. Zheng Y, Li S, Hu R, et al. GFI-1 Protects Against Lipopolysaccharide-Induced Inflammatory Responses and Apoptosis by Inhibition of the NF-kappaB/TNF-alpha Pathway in H9c2 Cells[J]. Inflammation, 2019.
5. Ji R, Zhang X, Gu H, et al. miR-374a-5p: A New Target for Diagnosis and Drug Resistance Therapy in Gastric Cancer[J]. Mol Ther Nucleic Acids, 2019, 18: 320-331.
轉(zhuǎn)自：利用流式細(xì)胞儀測細(xì)胞凋亡（Apoptosis） Annexin V/PI染色法_清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)測試中心 http://center.biomed.tsinghua.edu.cn/index.php?c=show&id=409
