支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中普遍存在的現(xiàn)象也是科研工作者的噩夢，支原體污染不及時發(fā)現(xiàn)往往意味著大量時間，精力和資金的浪費(fèi)。對此nature的《Contamination hits cell work 》（https://www.nature.com/news/contamination-hits-cell-work-1.15632）進(jìn)行了詳細(xì)的報道。

????在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，支原體污染發(fā)生的頻率很高，但常常為人所忽視，原因在于支原體污染的培養(yǎng)液可能不發(fā)生混濁的現(xiàn)象，這就導(dǎo)致了很難被肉眼所觀察到。其次被支原體污染的細(xì)胞病理變化輕微或不顯著 而且被支原體污染的細(xì)胞的細(xì)微變化也可由于傳代，換液而緩解。只有個別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落，以上種種原因?qū)е铝酥гw污染很難被發(fā)現(xiàn)。雖然支原體污染很難被發(fā)現(xiàn)但是支原體幾乎影響細(xì)胞的每一個方面。例如支原體會和宿主細(xì)胞競爭營養(yǎng)，改變細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成狀態(tài)，降低培養(yǎng)液中氨基酸和ATP水平，誘導(dǎo)細(xì)胞染色體改變，改變細(xì)胞膜抗原結(jié)構(gòu)等。其結(jié)果是細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞死亡增加，DNA發(fā)生片段化，產(chǎn)生類似凋亡的形態(tài)特征。支原體造成細(xì)胞的改變大家可以參見《支原體污染細(xì)胞的危害有多大》《大量細(xì)胞研究被支原體污染所摧毀》《支原體污染細(xì)胞的嚴(yán)重影響》這幾篇軟文來一個定性的了解。

支原體污染可以采用多種方法進(jìn)行檢測。?檢測方法

一般根據(jù)支原體種類不同，采取不同的方法進(jìn)行檢測。目前實(shí)驗(yàn)上常用的檢測方法有培養(yǎng)法， DNA熒光染色法， 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法， 電子顯微鏡法 ，相差顯微鏡檢測 ，3-H胸腺嘧啶摻入法， 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光法 ，低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察等等。

但很多時候，客戶往往忘記了支原體污染的檢測，而在真正拿到測序結(jié)果的時候才大呼”糟糕“（如NT庫比對結(jié)果，支原體污染如紅框所示），如果是測序據(jù)量小還好，畢竟造成的損失還能承受，如果是大數(shù)據(jù)量的測序，恐怕就得悔不當(dāng)初了。

知道了支原體污染的風(fēng)險，作為一名生信數(shù)據(jù)分析者，當(dāng)然第一時間進(jìn)行采用Blast進(jìn)行NT庫比對啦，那么具體的操作步驟又如何呢？

首先第一步在linux下安裝blast并創(chuàng)建nt數(shù)據(jù)庫

NT庫格式如下：

第二步 由于NT庫比對比較耗內(nèi)存，那么針對clean的Reads，我們可以隨機(jī)選取10，000 reads轉(zhuǎn)換成fasta格式進(jìn)行nt庫比對。

第三步 采用以下命令進(jìn)行NT庫比對

blastn ?-db ?nt?-evalue 0.001 -outfmt 5? -query ?Lib1_blast.fasta?-out ?Lib1.xml ?-num_threads 4?

通過blast NT庫比對最終，我們就可以確定污染源了～～

但是要強(qiáng)調(diào)的是在做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時，一定要提前做好支原體污染的檢測，不要等到測序結(jié)果出來了再追悔莫及～～