構(gòu)建tPD-L1 KO的腫瘤細(xì)胞系[CRISPR/Cas9]：

1.病毒構(gòu)建

2.腫瘤細(xì)胞與病毒顆粒在12孔板中共培養(yǎng)（5x10^5 細(xì)胞/孔），直到細(xì)胞達(dá)到30-50%的confluence：? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.1 加入稀釋液[2.5ml 50% OPTI-MEM+50% DMEM]，37℃過夜? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.2 將基質(zhì)液吸引掉，加入混合液[0.5ml 病毒溶液+0.5ml RPMI+0.6ul 凝聚胺polybrene]，混合，37℃，48-60h? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?2.3 收集細(xì)胞到10-cm dish中，培養(yǎng)。加入嘌呤霉素puromycin(5ug/ml) 3天[篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞]

3.30ng/ml mIFNγ刺激過夜[IFNγ刺激PD-L1表達(dá)]

4.BD流式分選

a defined in vitro CTL-tumorinteraction system：

2/20 CTL——4T1 or CT26

2/20 CTL細(xì)胞系不需要從naive狀態(tài)分化

2種肺轉(zhuǎn)移模型：

1.4T1自發(fā)肺轉(zhuǎn)移模型

2.實驗肺轉(zhuǎn)移模型

methylcholanthrene，MCA 甲基膽蒽誘導(dǎo)腫瘤形成：

小鼠皮下注射100ug甲基膽蒽

3個月后可取腫瘤

BMDM(Bone marrow-derived macrophage) generation and treatment:

1.取小鼠股骨、脛骨，置于70%乙醇中消毒10min，后用PBS沖洗

2.用RPMI(1640)沖洗骨髓腔

3.將骨髓細(xì)胞混合液制成單細(xì)胞懸液：過100uM濾網(wǎng)，裂紅

4.將5×10^6骨髓細(xì)胞置于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿(culture dish)中，皿中為完全培養(yǎng)基+50ng/ml mM-CSF。培養(yǎng)第三天更換新的培養(yǎng)基

5.第6-7天，收集巨噬細(xì)胞至PBD+1mM EDTA中

6.流式檢測純度[CD45+CD11b+F4/80+]

髓系細(xì)胞清除實驗：

有研究證明：氯磷酸鹽脂質(zhì)體能夠通過清除巨噬細(xì)胞、髓系細(xì)胞促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移