作者：biofan
審稿：童蒙
編輯：amethyst
科學(xué)家曾一度以為，人體是一座自給自足的小島
- 我們能感受自身的信號(hào)并及時(shí)調(diào)控行為。例如：餓了渴了，吃頓好的；冷了熱了，更換衣物。
- 我們的身體能分泌消化酶消化食物，我們的免疫細(xì)胞能識(shí)別危險(xiǎn)的病原體，并及時(shí)進(jìn)入戰(zhàn)斗狀態(tài)。
然而，科學(xué)家逐漸發(fā)現(xiàn)，人體并不是一座孤立的小島，而是一個(gè)龐大的生態(tài)系統(tǒng)。在這個(gè)系統(tǒng)里，有著我們的“土著民”——大概50萬(wàn)億細(xì)胞，也有著體型較小的“移民者”——大概500萬(wàn)億微生物，足足是我們的土著民細(xì)胞的10倍之多。
他們聚居在我們的皮膚，生殖器，口腔以及腸道。這些“移民者” 人龍混雜，既有能幫助身體進(jìn)行消化、生長(zhǎng)和防御，對(duì)人體“社會(huì)”的有貢獻(xiàn)的菌落，也有一些危害“公共安全”的病原微生物。然而，有害和有益的概念也并非非黑即白，更多的是需要特定的情境。
而在近年來(lái)，造成人類(lèi)感染的病原微生物日益復(fù)雜，種類(lèi)增多，這些”外來(lái)入侵者“已造成嚴(yán)重的公共恐慌和經(jīng)濟(jì)損失。成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。常見(jiàn)的病原微生物包括 病毒（virus），細(xì)菌（bacteria），真菌（fungi）以及寄生蟲(chóng)（protozoa）。
人類(lèi)歷史的幾次浩劫也與之息息相關(guān)，比如當(dāng)前的新冠病毒導(dǎo)致的肺炎肆虐全球。歷史上由鼠疫桿菌傳播導(dǎo)致的鼠疫大流行使得歐洲人口銳減。而由瘧原蟲(chóng)傳播的瘧疾，直到今天還是熱帶地區(qū)主要傳染病之一。
除了重大公共衛(wèi)生事件，感染是臨床上危重病人死亡的主要原因，比如說(shuō)膿毒癥的死亡率高達(dá)50%，因此快速診斷病原體，對(duì)癥用藥，是核心。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法在敏感性，特異性以及失效性存在局限。
新一代測(cè)序技術(shù)（mNGS）不依賴(lài)傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)，直接高通量測(cè)序，快速識(shí)別樣本的病原微生物，尤其適用于急危重癥和疑難感染的診斷，而這一點(diǎn)已達(dá)成了專(zhuān)家共識(shí)，具體可以參見(jiàn)2019年中華急診雜志發(fā)表的《宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專(zhuān)家共識(shí)》。
其大致流程如下圖。主要分為：
- 樣品采集
- 實(shí)驗(yàn)建庫(kù)和測(cè)序
- 信息分析流程
樣品采集要求
在《宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專(zhuān)家共識(shí)》里，針對(duì)實(shí)驗(yàn)方面的樣本收集以及具體規(guī)范嚴(yán)格的操作都有清晰的說(shuō)明，需要大家仔細(xì)閱讀，比如樣本采集注意事項(xiàng)：
嚴(yán)格無(wú)菌操作 : 采集無(wú)菌標(biāo)本時(shí)應(yīng)注意對(duì)局部及周?chē)つw的消毒。
無(wú)菌部位的標(biāo)本具有更高的臨床價(jià)值，采集過(guò)程應(yīng)盡可能的減少“有菌部位正常菌群導(dǎo)致標(biāo)本的 污染”。
標(biāo)本的種類(lèi)。原則上，送檢感染部位的體液或者組織標(biāo)本敏感性、特異性和可信度更高。比如對(duì)于重癥肺部感染患者，痰液 / 肺泡 灌洗液和血液標(biāo)本檢測(cè)病原體的一致性?xún)H僅為 40%~50%。
而病原微生物檢測(cè)主要樣本組織采集類(lèi)型如下：
其中采集采集中有一些注意操作事項(xiàng) 比如靜脈血，采集后要輕輕顛倒混勻，避免凝固，但動(dòng)作不要太過(guò)激烈，防止溶血，痰液的話(huà)，要用清水漱口2-3次，用力咳出肺部深處痰液放入無(wú)菌杯中......
實(shí)驗(yàn)建庫(kù)測(cè)序
樣本采集之后就是實(shí)驗(yàn)建庫(kù)和測(cè)序的部分了（如下圖左）：
由于采集到的樣本本身大多含有致病性病原菌，需要及時(shí)滅活處理，提取核酸并定量。文庫(kù)制備流程如上圖，如果提取的是RNA需要反轉(zhuǎn)錄成DNA文庫(kù)，之后再進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建包括DNA 打 斷、接頭連接、PCR 擴(kuò)增等過(guò)程，檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量合格上機(jī)測(cè)序。注意每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)包括內(nèi)參、陰性和陽(yáng)性對(duì)照來(lái)達(dá)到質(zhì)控的效果。
信息分析流程
一般而言，mNGS的成功除了嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)條件之外呢，還需要嚴(yán)格的信息分析的流程?；静襟E如下：
1.數(shù)據(jù)質(zhì)控
2.去除人基因組
3.與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定病原微生物
4.生成報(bào)告
參考文獻(xiàn)
1.IDseq—An open source cloud-based pipeline and analysis service for metagenomic pathogen detection and monitoring
2.A cloud-compatible bioinformatics pipeline for ultrarapid pathogen identification from next-generation sequencing of clinical samples
3.Improved metagenomic analysis with Kraken 2
4.宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專(zhuān)家共識(shí)
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